豬支原體肺炎診斷方法及其病原P46基因原核表達(dá)的研究.pdf

1、豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的豬的一種高發(fā)病率，低死亡率的慢性呼吸道傳染病，在我國常被稱為豬氣喘病(或喘氣病)。MPS廣泛分布于世界各地，豬群中Mhp的感染率在30％～80％，目前大多數(shù)養(yǎng)豬國家均報道有此病的發(fā)生。病豬長期生長發(fā)育不良，生長率和飼料轉(zhuǎn)化率降低，一般死亡率不高，但繼發(fā)性感染也會造成嚴(yán)重死亡

2、，所致的經(jīng)濟(jì)損失很大，對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展帶來嚴(yán)重危害，所以該病是最常發(fā)生和經(jīng)濟(jì)意義重大的豬病之一。因此，建立可靠實用的MPS快速診斷技術(shù)，以便控制和預(yù)防該病已成為目前豬病防治的重要研究內(nèi)容。 本試驗調(diào)查了陜西省寶雞、楊凌地區(qū)自然感染豬支原體肺炎的病例，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和癥狀觀察表明，MPS不同年齡、性別和品種的豬均能感染，但其中哺乳仔豬及幼齡豬發(fā)病率及病死率最高；臨床癥狀可表現(xiàn)為急性、慢性或隱性經(jīng)過。通過病理剖檢和組織學(xué)觀察表明，MP

3、S病理變化的主要特征是融合性支氣管肺炎，于肺臟的不同部位呈“肉樣”或“蝦肉樣”實變；組織學(xué)變化以細(xì)支氣管腔和肺泡腔內(nèi)細(xì)胞浸潤為特征；另外肝、脾、腎等器官也發(fā)生不同程度的腫大及組織細(xì)胞的浸潤。 參照已發(fā)表的豬肺炎支原體P46基因序列，設(shè)計合成了1對引物，用此引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符的目的片段。目的片段的序列比較結(jié)果表明分離菌株與參考菌株同源性為98.5％。結(jié)果表明，此試驗中建立的PCR檢測方法是成功的。用該方法同時擴(kuò)增肺

4、炎雙球菌、羊鏈球菌、結(jié)核分支桿菌，除豬肺炎支原體擴(kuò)增出一特異的條帶外，其余的均無條帶產(chǎn)生，證明了該PCR檢測方法具有很強(qiáng)的特異性。對于PCR的敏感性試驗顯示這對引物能夠檢測到1ng的DNA，說明具有較強(qiáng)的靈敏度。PCR．?dāng)U增采集的病料檢測結(jié)果與臨床診斷和病理學(xué)診斷結(jié)果完全一致。 將Mhp的P46基因克隆于pET-32a原核表達(dá)載體T7啟動子的下游，構(gòu)建了pET-P46原核表達(dá)載體。該載體在其宿主菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)大小