豬肺炎支原體P46基因的克隆表達(dá)及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、豬氣喘病的病原體是豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，該病分布廣泛，發(fā)病率高，自身致死率不高，但由于Mhp能破壞呼吸道黏膜-纖毛屏障，從而繼發(fā)其他致病菌的感染，導(dǎo)致死亡率提高。此病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)對(duì)本病尚未有較好的血清學(xué)檢測(cè)方法，本試驗(yàn)利用表達(dá)純化的Mhp P46蛋白，初步建立了檢測(cè)Mhp抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。
　　 1、參考GenBank登錄的豬肺

2、炎支原體(Mhp)P46基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物，利用重疊延伸PCR(SOE PCR)對(duì)MhpP46基因的三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將Mhp P46基因序列中三個(gè)編碼Trp的密碼子TGA突變?yōu)門GG，突變后基因克隆到pMD18-T載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定構(gòu)建正確的陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明突變成功。突變后的Mhp P46基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a(+)/P46，鑒定成功后，

3、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功地在大腸桿菌Rosetta(DE3)宿主菌中高效表達(dá)分子量約為63.5kDa的融合蛋白，并優(yōu)化了最佳的表達(dá)條件。Western blot分析表明該融合蛋白具有反應(yīng)原性。
　　 2、以純化后重組融合蛋白為抗原，初步建立了檢測(cè)Mhp抗體的間接ELISA方法，確定了MhpP46蛋白抗原的最適包被濃度為0.8μg/mL,最適封閉液為5％脫脂乳，檢測(cè)血清稀釋度為1∶20，抗原和抗體的作用時(shí)間為30min，HRP-兔抗豬