豬肺炎支原體ELISA抗體檢測方法的研究和核苷酸還原酶基因的克隆.pdf

1、豬支原體肺炎（Myeoplasma pneumoniae of swine，MPS）又稱豬地方流行性肺炎（Enzootic pneumoniae of Swine，EPS），是由豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病，主要癥狀為咳嗽和氣喘。其特征為高發(fā)病率，低死亡率，患豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低，廣泛分布于世界各地。該病原體常與巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌等混合感染。利用其特異

2、性蛋白建立診斷方法是目前研究的熱點。在血清學(xué)檢測方法中，ELISA方法具有方便、快速、敏感性和特異性高等特點，在動物疾病的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。另外，豬肺炎支原體核苷酸還原酶基因的克隆為基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)，對于本病的控制有重要的現(xiàn)實意義。為此，本研究開展了以下兩方面的工作。 1．豬肺炎支原體ELISA抗體檢測方法的建立和應(yīng)用 近年來研究發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶基因L,DH是豬肺炎支原體的種屬特異性基因。根據(jù)Genbank

3、中豬肺炎支原體乳酸脫氫酶基因（LDH）基因序列設(shè)計一對引物，PCR擴(kuò)增L,DH基因，首先將擴(kuò)增片段連接到pMD18-T上，然后連接到表達(dá)載體pGEX-KG上進(jìn)行序列測定，經(jīng)測序正確后誘導(dǎo)表達(dá)。目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物以可溶性蛋白和包涵體二種形式存在，大小與預(yù)期相符。將超聲波破碎的誘導(dǎo)菌液高速離心后其上清用Glutathione Sepharose 4B bead親和層析純化。用豬肺炎支原體的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對純化蛋白作Western-

4、blot檢測，出現(xiàn)目的條帶。以純化蛋白為抗原建立了檢測豬肺炎支原體抗體的間接ELISA方法，該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，較高的特異性與敏感性。用建立的ELISA方法與中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的IHA試劑盒同時檢測120份臨床血清，二者總符合率為92.5％。用建立的ELISA方法檢測了671份臨床送檢不同年齡階段的豬血清，結(jié)果顯示斷奶前仔豬Mhp感染率為44.3％，保育豬為3.0％，育肥豬為17.44％，種豬為73.41％，這初步反映了

5、豬喘氣病在各個年齡階段的感染率。本研究建立的LDH-ELISA為豬支原體肺炎抗體檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了有用的技術(shù)手段。 2．豬肺炎支原體核苷酸還原酶（nrdF）基因的克隆豬肺炎支原體核苷酸還原酶基因R<,2>亞基C末端具有良好的免疫原性，其抗血清可以抑制豬肺炎支原體的生長。本研究根據(jù)Peter K等（1996）文章中的nrdF基因R<,2>亞基C末端的822bp核苷酸片段設(shè)計了一對引物，PCR擴(kuò)增了該片段，首先將其連接到克隆載