綿羊肺炎支原體LY-1株分離鑒定及HSP70 P30基因克隆和序列分析.pdf

1、羊傳染性胸膜肺炎是由支原體引起的羊的一種高度接觸性傳染病，綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）是其重要病原之一。本研究從發(fā)病羊的肺臟病料中成功分離出1株綿羊肺炎支原體，并對其生物學(xué)特性和免疫原性基因等進行了系統(tǒng)研究，得到了以下研究結(jié)果：
　　1.2016年11月，河南省盧氏縣某規(guī)?；驁霭l(fā)生疑似綿羊傳染性胸膜肺炎的病例。羔羊和成年羊均可發(fā)生，但羔羊癥狀表現(xiàn)較重。羔羊死亡率約30％，成年羊未見死亡。病

2、羊體溫升高、精神沉郁、食欲減退、咳嗽、呼吸困難和突然死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)其以胸、胸膜和肺臟的漿液性和纖維素性炎癥為主要病變特征，具體表現(xiàn)為胸腔和心包有淡黃色積液，胸膜變厚而粗糙，上有黃白色纖維素性沉積，部分羊只發(fā)生胸膜與肋膜、心包發(fā)生粘連；肺表面有出血點，肺小葉間組織變寬，肺臟色澤變暗等典型病變。通過臨床癥狀和病理剖檢，初步判定該病為綿羊傳染性胸膜肺炎。
　　2.從發(fā)病羊的肺臟病料中分離鑒定出1株疑似支原體，命名為 LY-1株。該菌培養(yǎng)

3、困難，但在 PPLO固體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃靜置培養(yǎng)5~7日，可長成圓形、透明、露滴狀的針尖大小的菌落；培養(yǎng)14~16日，可長成圓形、中心發(fā)暗、周圍透明、直徑2~3 mm的“煎荷包蛋”狀菌落。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明，該菌呈球狀、兩極狀、桿狀等的多形性。生化試驗結(jié)果表明，該菌能發(fā)酵葡萄糖，但不能利用精氨酸與尿素。上述培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)和生化特性均符合支原體的特征。藥敏試驗結(jié)果表明，該菌對阿奇霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星高度敏感；對四環(huán)素中度敏感

4、，對紅霉素、慶大霉素和卡那霉素具有耐藥性。
　　3.提取該菌的基因組為模板，使用支原體 PCR檢測試劑盒鑒定，確定該菌為支原體；進一步使用特異性引物 PCR鑒定該菌為綿羊肺炎支原體（361 bp）。PCR擴增其16S rRNA全基因（1469 bp）并進行測序和 BLAST比對分析，與其同源性最高的均為 NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)布的綿羊肺炎支原體的16S rRNA基因序列，其同源性均在99%以上。進一步構(gòu)建16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育

5、樹，表明LY-1株與綿羊肺炎支原體FJ-FZ株和FJ-SM株親緣關(guān)系最近。以上鑒定結(jié)果均表明LY-1分離株為綿羊肺炎支原體。
　　4.熱休克蛋白 HSP70和黏附因子蛋白 P30是支原體重要的保護性抗原因子。以LY-1株基因組為模板，分別擴增了其大小為738 bp的HSP70基因和786 bp的P30基因，BLAST比對結(jié)果表明，HSP70基因與NCBI已報到豬肺炎支原體序列 CP003131.1的同源為77%。P30基因與 NC