綿羊肺炎支原體(Y-98標準株)P30基因真核表達載體構建與P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma oumvipneonia,MO)是綿羊養(yǎng)殖過程中的常見病原菌,可以引發(fā)綿羊支原體腫炎。該病流行范圍廣,發(fā)病期長,給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經濟損失。
　　本文選擇P30外膜蛋白為抗原蛋白,同時以細胞因子IFNγ為疫苗佐劑,將兩者串聯(lián)融合表達。以綿羊肺炎支原體(MO)標準株Y98基因組為模板,設計一對特異性引物,PCR擴增得到795bp的P30目的基因,與文獻報道的P30基因序列一致;提取小鼠總RNA

2、,設計特異性引物,通過RT-PCR擴增IFNγ目的基因。將兩者定向克隆到原核表達載體pET-22b(+)中,得到pET-P30、pET-IFNγ和pET-P30-IFNγ重組質粒,轉化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)。重組菌株分別命名為BL21(DE3)(pET-P30)、BL21(DE3)(pET-IFNγ)和BL21(DE3)(pET-P30-IFNγ)。由IPTG誘導表達后,經SDS-PAGE及Western blot分析,得到3

3、0.0KD、20.1KD和47.2KD的特異條帶,與預期的P30外膜蛋白、IFNγ以及P30-IFNγ融合蛋白大小一致,且均具有良好的反應原性。
　　對3種重組菌株進行誘導表達,純化得到可溶性目的蛋白,制備P30基因工程疫苗、IFNγ佐劑疫苗以及P30-IFNγ融合蛋白疫苗。小鼠免疫保護實驗結果顯示,P30基因工程疫苗的免疫保護率為60％,IFNγ佐劑疫苗的免疫保護率為20％,P30-IFNγ融合蛋白疫苗的免疫保護率達到80％。間

4、接ELISA實驗證實,經100μL與200μL劑量P30-IFNγ融合蛋白疫苗免疫的小鼠血清中,P30抗體效價分別為1:32000與1:64000。經IFNγ佐劑疫苗免疫的小鼠血清中,未檢測出陽性P30抗體效價。以上結果證實,所制備的疫苗安全有效,且融合蛋白疫苗中的細胞因子IFNγ組分可以調節(jié)機體免疫機能,增強疫苗的免疫保護效果。
　　結合近年來疫苗研制領域的發(fā)展動念,本研究還對轉基因植物疫苗的研制進行了探究。設計特異性引物,擴增

5、了P30目的基因,將其定向克隆到含黃色熒光蛋白(yellowfluorescent protein,YFP)標簽的真核表達載體pCAMBIA1300-YFP中,構建了重組表達質粒pCAMBIA1300-P30-YFP并轉化農桿菌(Agrobacterium)感受念細胞,侵染煙草(tobacco)葉片。通過激光共聚焦成像顯微鏡(cofocal imaging microscope)觀察到融合表達的黃色熒光蛋白P30-YFP,Western