肺炎支原體Ohr樣蛋白的結(jié)構(gòu)及功能的初步研究.pdf

1、目的:研究肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重組MPN668蛋白是否具有降解有機(jī)氫過氧化物(Organic Hydroperoxide,OHP)的能力,并通過分子模擬解析rMPN668的結(jié)構(gòu),初步分析其結(jié)構(gòu)與酶活性的關(guān)系,以進(jìn)一步了解Mp的致病機(jī)制。
　　方法:以Mp129株基因組DNA為模板,PCR法擴(kuò)增目的基因mpn668,將其亞克隆至pGEX-6P-1載體中。經(jīng)鑒定后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli

2、BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western blotting等方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定并純化GST融合蛋白;切除重組蛋白GST標(biāo)簽后,采用氧化鐵二甲酚橙(Ferrous Oxidation-Xylenol Orange,FOX)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其氫過氧化物酶活性。固體培養(yǎng)Mp,隨后將其置于氧化應(yīng)激條件下培養(yǎng)3~5d,RT-PCR檢測(cè)mpn668 mRNA的表達(dá)水平。利用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)等方法,通過軟件 Expasy與 V

3、isual Molecular Dynamics(VMD)模擬rMPN668的分子結(jié)構(gòu),并對(duì)其已預(yù)測(cè)出的酶活性位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得△rMPN668突變蛋白, FOX實(shí)驗(yàn)測(cè)定其氫過氧化物酶活性。
　　結(jié)果:成功擴(kuò)增出總長(zhǎng)度為423bp的mpn668基因,所構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切以及測(cè)序鑒定與預(yù)期目的基因相符。SDS-PAGE顯示,IPTG可誘導(dǎo)一分子量約為41KD的可溶性GST融合蛋白,經(jīng)GST?B

4、ind? Purification Kit純化后,純度可達(dá)95％以上。FOX實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)Prescission protease切除GST標(biāo)簽的rMPN668能降解有機(jī)氫過氧化物叔丁基過氧化氫( tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)以及無機(jī)H2O2,其降解能力與rMPN668濃度呈正相關(guān);催化t-BHP時(shí),20ng/μL rMPN668在2min內(nèi)降解約500μM t-BHP,而催化H2O2反應(yīng)時(shí),催化效率遠(yuǎn)低

5、于此水平,200ng/μL rMPN668降解500μM H2O2需要35min以上。RT-PCR分析表明,Mp在不同濃度的t-BHP(0.05M~1.00M)和氫過氧化枯烯(cumene hydroperoxide,CHP)(0.05M~1.00M)條件下,mpn668基因表達(dá)水平隨著t-BHP和CHP濃度增大而升高;模擬的分子模型顯示,rMPN668的二級(jí)結(jié)構(gòu)序列為β1-β2-β3-α1-β4-β5-α2-α3-β6,Cys55可能