胸膜肺炎放線桿菌CpxA-R雙組份調(diào)控系統(tǒng)基因缺失突變株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)，是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬的傳染性呼吸道疾病，是造成世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失的一個主要問題。臨床上，該病以肺部有出血性，纖維素性滲出和壞死性損害為主要診斷特征，隨著耐藥菌株的出現(xiàn)而變得日趨難以應(yīng)對。盡管目前很多與APP致病有關(guān)的毒力因子已被報道，但由于其調(diào)控網(wǎng)

2、絡(luò)錯綜復(fù)雜，它們在APP的整個感染和致病過程中究竟起著怎么樣的作用，目前仍不完全清楚。
　　 雙組份調(diào)控系統(tǒng)(Two-Component Regulatory System，TCS)是細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境變化最普遍的信號傳遞裝置，通過感知外界環(huán)境信號變化并做出應(yīng)答從而適應(yīng)生長環(huán)境的變化。此外，在病原菌的感染過程中發(fā)揮著重要的作用，如調(diào)節(jié)細(xì)菌生長代謝、耐藥性、毒力表達(dá)等。對已完成測序的APP血清3型JL03全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，在AP

3、P中共有五對雙組份，分別是ArcA/ArcB，CpxA/CpxR，NarP/NarQ，PhoB/PhoR，QseB/QseC。CpxA/R是一個典型的對膜壓做出調(diào)控反應(yīng)的雙組份調(diào)控系統(tǒng)，負(fù)責(zé)監(jiān)控和維持外膜結(jié)構(gòu)的完整性，參與菌毛的合成，調(diào)節(jié)毒力基因的表達(dá)。在多種病原菌致病中發(fā)揮重要作用。
　　 鑒于以上背景，本課題以目前國內(nèi)流行的APP血清1型強毒株SLW01為親本菌株，參照本實驗室已經(jīng)測序完成的APP血清3型JL03菌株全基因組

4、測序結(jié)果，通過負(fù)向篩選和同源重組缺失了APP雙組份調(diào)控系統(tǒng)CpxA/R基因，進一步開展了缺失突變株生物學(xué)特性及對小鼠毒力相關(guān)研究。主要研究內(nèi)容包括:
　　 1.APP雙組份調(diào)控系統(tǒng)雙基因缺失突變株△CpxA/R及互補菌株C△CpxA/R構(gòu)建與鑒定
　　 參照已測序JL03 CpxA、CpxR基因序列，以SLW01基因組為模板，擴增CpxA/R雙基因的上下游同源臂片段，通過T/A克隆將擴增的同源臂連接到PMD-18T載體上

5、，酶切回收，依次連接到自殺性質(zhì)粒pEMOC2上，酶切鑒定成功構(gòu)建了缺失2300bp的重組自殺性質(zhì)粒pEM-CpxA/R。經(jīng)測序，同源臂序列與模板序列100％同源。將重組自殺性質(zhì)粒pEM-CpxA/R轉(zhuǎn)化到大腸桿菌β2155中并以此作為供體菌，與受體菌SLW01進行結(jié)合轉(zhuǎn)移，獲得整合了重組自殺性質(zhì)粒pEM-CpxA/R的單交換菌株，利用負(fù)向篩選和同源重組的方法篩選出氯霉素敏感、蔗糖抗性的克隆，通過PCR鑒定，確定其發(fā)生了第二次的單交換。并

6、進一步測序、Southern blotting證實雙基因缺失突變株構(gòu)建成功。
　　 參照APP血清3型JL03基因序列，設(shè)計引物，以SLW01基因組為模板，擴增出CpxA/R雙基因序列，連接到APP-Escherichia.coli穿梭質(zhì)粒PJFF224-XN上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PJFF-CpxA/R，將重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入雙基因缺失突變株△CpxA/R，經(jīng)PCR鑒定，互補菌株C△CpxA/R構(gòu)建成功。
　　 2.雙基因缺

7、失突變株△CpxA/R生物學(xué)特性及對小鼠毒力研究
　　 為了檢驗CpxA/R缺失對細(xì)菌生長的影響，將SLW01、△CpxA/R、C△CpxA/R劃平皿復(fù)蘇，挑取單菌落，37℃搖床過夜，1∶1000轉(zhuǎn)接，活菌計數(shù)，并根據(jù)OD600吸光值繪制生長曲線。從生長曲線看，缺失株△CpxA/R相比較SLW01、C△CpxA/R生長稍慢，但差異不顯著。這說明CpxA/R的缺失對該菌的生長活性影響不大。將SLW01、△CpxA/R、C△CpxA

8、/R的單菌落劃區(qū)接種于10％新鮮綿羊血NAD平皿上，37℃溫箱中放置24h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株與野生株和互補菌株的溶血活性差異不明顯。選取六周齡Balb/C小鼠測定SLW01、△CpxA/R、C△CpxA/R三株菌的LD50，結(jié)果表明突變株△CpxA/R與野生株SLW01相比毒力下降5.36倍，而互補菌株與野生株基本無差異。細(xì)菌掃描切片電鏡觀察三株菌外觀形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)缺失株△CpxA/R的莢膜厚度與親本株及互補菌株相比無明顯改變，但形態(tài)發(fā)

9、生了一定程度的改變，界線變得模糊。這說明△CpxA/R的缺失可能影響到了APP周質(zhì)外膜蛋白的合成以及后期的折疊、加工等。利用PK-15細(xì)胞測試缺失株與野生株的黏附和侵入能力，發(fā)現(xiàn)△CpxA/R缺失后細(xì)菌的黏附和侵入能力均顯著下降。利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW測試缺失株與野生株的抗吞噬能力，結(jié)果顯示△CpxA/R缺失后細(xì)菌更容易被吞噬殺死。以上結(jié)果表明:APP雙組份調(diào)控系統(tǒng)缺失后導(dǎo)致細(xì)菌毒力降低。
　　 3.熒光定量篩選受調(diào)控的差異表達(dá)

10、基因
　　 參考文獻(xiàn)，通過生物信息學(xué)分析篩選出胸膜肺炎放線桿菌11個基因或蛋白與物質(zhì)轉(zhuǎn)運、菌毛合成、外膜蛋白相關(guān)，可能受CpxA/R雙組份調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控。通過熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有8個基因發(fā)生顯著差異表達(dá)，其中6個下調(diào)表達(dá)，2個上調(diào)表達(dá)。通過以上試驗結(jié)果表明雙組份調(diào)控系統(tǒng)CpxA/R可能通過調(diào)節(jié)細(xì)菌表面外膜蛋白、菌毛等毒力因子的表達(dá)從而影響APP的致病性。
　　 4.雙組份調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控蛋白CpxR表達(dá)和純化