鴨疫里氏桿菌ECFs sigma基因缺失突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的家鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種細(xì)菌性傳染病，由于該病分布范圍廣、發(fā)病率和死亡率高，現(xiàn)已成為危害世界養(yǎng)鴨業(yè)的重要的傳染病之一。由于RA血清型較多，血清型之間交叉保護(hù)作用低，目前在生產(chǎn)中對(duì)該病的防控主要使用抗生素，但RA對(duì)抗生素易產(chǎn)生耐藥性，并且容易造成食品中的藥物殘留。因此，加強(qiáng)RA分子生物學(xué)、致病和免疫機(jī)制的研究，對(duì)從根本上防制該病的發(fā)生具有重

2、要的意義。
　　σ因子是細(xì)菌DNA依賴的RNA聚合酶的一個(gè)亞基，它識(shí)別啟動(dòng)子共有序列且與核心酶結(jié)合起始基因轉(zhuǎn)錄。胞質(zhì)外功能性σ因子(Extracytoplasmic fuctional sigma factors，ECFs)屬于σ70蛋白家族，它介導(dǎo)細(xì)菌在面對(duì)環(huán)境變化時(shí)做出適應(yīng)性反應(yīng)。ECF因子在病原菌適應(yīng)外界環(huán)境脅迫、侵襲和感染宿主的過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　鴨疫里氏桿菌RA-YM株基因組中含有5個(gè)編碼ECF因子的基因

3、，為了研究ECF因子在鴨疫里氏桿菌致病中的作用，本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了RA-YM株ECFs（RAYM03547、RAYM00365、RAYM08835）基因缺失突變株，對(duì)基因缺失突變株的生長特性、生化特性、對(duì)雛鴨致病性以及在環(huán)境脅迫情況下的生長特性進(jìn)行了研究。具體研究內(nèi)容如下:
　　1、鴨疫里氏桿菌RA-YM株ECFs基因缺失突變株的構(gòu)建與鑒定
　　以RA-YM株基因組為模板，分別擴(kuò)增ECFs(RAYM_00365、R

4、AYM_08835、RAYM_03547)基因上、下游同源臂，采用重疊PCR方法將上、下游同源臂與壯觀霉素基因連接在一起，構(gòu)建壯觀霉素抗性基因表達(dá)盒并連接到自殺性質(zhì)粒pRE-112。將構(gòu)建成功的自殺性質(zhì)粒pRE-ECF轉(zhuǎn)化E.coli X7213，以含有pRE-ECF的E.coli X7213作為供體菌，以RA-YM株為受體菌，采用雙親本接合轉(zhuǎn)移的方法篩選RA-YM株ECF突變株。挑取壯觀抗性TSA平板上的菌落，連續(xù)傳5代，利用PCR鑒

5、定ECF缺失突變株，成功構(gòu)建了鴨疫里氏桿菌3個(gè)ECF基因（RAYM_03547、RAYM_00365、RAYM_08835）缺失突變株。
　　2、鴨疫里氏桿菌RA-YM株ECFs基因缺失突變株生物學(xué)特性研究
　　比較了RA-YM株ECFs基因缺失突變株RA-YM△RAYM_00365、RA-YM△RAYM_08835、RA-YM△RAYM_03574與親本株的生長特性和生化特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)ECF基因缺失突變株與親本株在對(duì)數(shù)

6、生長期的生長速度差異不明顯，ECF基因基因缺失突變株的生化特性沒有發(fā)生改變。比較ECFs基因基因缺失突變株與RA-YM在環(huán)境脅迫下的生長發(fā)現(xiàn):3個(gè)ECFs基因缺失突變株在含H2O2、膽鹽和酸性環(huán)境下生長變慢，表明ECFs基因缺失突變株對(duì)環(huán)境脅迫（H2O2、膽鹽、酸性）的耐受能力降低。
　　3、鴨疫里氏桿菌RA-YM株ECFs基因缺失突變株對(duì)雛鴨毒力研究
　　比較了3個(gè)ECF基因缺失突變株與親本株對(duì)10日齡雛鴨的毒力，結(jié)果顯示

7、RA-YM△RAYM_00365、RA-YM△RAYM_08835、RA-YM△RAYM_03574的LD50分別為3.16×106、3.98×106、5.01×106，與親本株（LD50為5.01×106）差異不大，ECFs基因缺失突變株與親本株在血液和肝臟組織的載菌量沒有顯著性差異(P＞0.05)。鑒于本研究中對(duì)3個(gè)ECFs基因缺失突變后，其致病性并沒有發(fā)生顯著性變化，推測(cè)原因可能是與毒力相關(guān)的ECF主效基因尚存在于基因組中有關(guān)，或