多殺性巴氏桿菌△rpoE突變株的構建及其生物學特性研究.pdf

1、兔多殺性巴氏桿菌病是一種急性敗血性傳染病，感染兔群可引起大規(guī)模死亡，對全世界養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。本實驗室前期成功構建多殺性巴氏桿菌△hfq突變株,對突變株和親本株進行了轉錄組測序，結果表明缺失hfq會導致rpoE表達上調，而 rpoE是一種sigma因子，控制基因的轉錄和蛋白質的翻譯，在維持細菌的生長和內環(huán)境的穩(wěn)定中起重要的作用，因此以 rpoE為研究對象。以 rpoE為目的基因，通過正向同源重組構建△rpoE缺失株，并進行生長特

2、性、遺傳穩(wěn)定性、抗逆性、粘附性、致病性以及調控功能的研究，明確 rpoE基因是否為多殺性巴氏桿菌的毒力基因，探索RpoE與Hfq的相互作用，為多殺性巴氏桿菌減毒疫苗的研制奠定基礎。
　　本研究以C51-17基因組為模板，PCR擴增rpoE基因的上下同源臂，將pUC-4K載體的KanR基因連在上下同源臂之間，共同連接到載體pBC-SK上，構建重組質粒pBC-SK-△rpoE，將其電轉入C51-17感受態(tài)細胞中，采用抗性篩選法篩選對K

3、anR和 CmS的菌株，用PCR進行驗證，成功構建了△rpoE突變株。以純化的重組蛋白RpoE免疫小鼠，制備血清作為一抗，Western blot對△rpoE突變株和親本株進行分析，結果表明：構建的△rpoE突變株中無RpoE的表達。通過生長特性試驗、遺傳穩(wěn)定性試驗、抗逆性試驗、粘附性試驗、致病性試驗和與Hfq相互作用試驗等研究△rpoE突變株的生物學特性，結果表明：通過每小時對OD600進行監(jiān)測，突變株生長良好，生長曲線與親本株無差別

4、；每隔5代對突變株進行 PCR驗證，突變株具有較好的穩(wěn)定性；在高鹽和低溫條件下對突變株與親本株OD600進行監(jiān)測，突變株生長緩慢，與親本株差異顯著；突變株與親本株對DF-1和RK-13細胞的粘附性差別不大，但對兔源細胞粘附性強于禽源；分別以1×102 CFU、1×104 CFU和1×106 CFU對小鼠攻毒，其中突變株以1×102 CFU攻毒死亡率為20％，以1×104 CFU攻毒死亡率為40%，1×106 CFU攻毒死亡率為100%，

5、通過計算確定突變株的LD50為1.89×103 CFU，而親本株以1×102 CFU攻毒后小鼠2 d內全部死亡，表明rpoE為多殺性巴氏桿菌中重要的毒力基因；通過pull down試驗驗證Hfq和RpoE在體外相互作用關系時二者反應結果陰性，說明在多殺性巴氏桿菌中二者之間可能間接調控或以蛋白-基因水平調控。
　　本研究利用正向重組技術成功獲得了△rpoE突變株，通過分析其致病性初步確定 rpoE為多殺性巴氏桿菌中的一種毒力基因，通