鴨疫里氏桿菌CH3的TbdR1缺失株構(gòu)建.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起鴨、鵝、火雞和其他禽類的一種接觸性傳染病,最常見于鴨。鴨疫里氏桿菌病發(fā)病率高、死亡率高;即使耐受過病的鴨,也因此影響生長速度,甚至形成僵鴨,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前人們對RA的分子致病機制等還知之甚少。
　　RA的GSM15868株的全基因組解析表明其基因組中含有31個編碼TonB依賴受體的基因,且它們之間的同源性很低,提示它們可能

2、在RA和宿主的相互作用過程中起著重要的作用。前期的研究表明,TonB依賴受體TbdR1是血清1型、2型和10型間的一種交叉免疫原性抗原。探究TbdR1的生物學功能對了解RA的分子致病機制十分有意義。
　　本研究首先用基因克隆測序的方法分析了tbdR1基因在不同血清型RA中的分布和同源性,結(jié)果表明所有檢測的RA菌株菌均攜帶tbdR1,且其氨基酸同源性高達98.2％-100%。其高度保守性提示該蛋白可能具有重要的生物學功能。
　

3、　其次,采用接合轉(zhuǎn)移的方法將重組性自殺質(zhì)粒pDS132-LSR導入RACH3株中,通過同源重組以1119bp的壯觀霉素抗性基因替代tbdR1基因ORF中的2726bp片段,從而獲得TbdR1的基因缺失株CH3ΔtbdR1。進一步將完整的TbdR1基因以及OmpA啟動子克隆到E.coli-RA穿梭表達載體pRES上,并將其回復到CH3ΔtbdR1中,從而獲得此缺失突變株的互補菌株cCH3ΔtbdR1。
　　為了檢驗TbdR1基因在鴨

4、疫里氏桿菌CH3株中,對于鐵離子的吸收中是否起著重要的作用,用二吡啶(DIP)螯合培養(yǎng)基中的鐵離子,比較了RA的野生CH3株、基因缺失株CH3ΔtbdR1和互補菌株cCH3ΔtbdR1在低鐵環(huán)境下的的生長繁殖情況,并在上述的培養(yǎng)基中加入不同形式的鐵離子(FeCl3或Hemin),研究TbdR1對CH3株獲鐵的影響;利用結(jié)晶紫染色的方法比較三株細菌的生物被膜形成能力是否具有差異;利用三株細菌黏附侵入Vero細胞的方法,比較它們對Vero細

5、胞的黏附與侵入能力;用動物攻毒試驗比較三株細菌的LD50,血液、肝臟和腦組織中的細菌載量,比較它們對雛鴨的致病性等方面的差異。結(jié)果表明,野生株CH3株和缺失株CH3ΔtbdR1在含200μmol/L鐵離子螯合劑DIP的TSB中均不能生長繁殖;在上述培養(yǎng)基中添加FeCl3后,野生株CH3和互補菌株能生長,而缺失株仍然不能,提示TbdR1在CH3株獲鐵過程起著重要的作用。進一步的研究表明,TbdR1與CH3株獲取Hemin有關(guān)。tbdR1缺

6、失顯著降低了CH3株的生物被膜形成能力,以及對Vero細胞的黏附和侵入能力。
　　動物試驗的結(jié)果顯示,缺失株CH3ΔtbdR1對鴨的LD50比野生毒株CH3高45倍。另外,缺失株CH3ΔtbdR1在接種雛鴨后24h鴨血液、肝臟以及腦組織中的細菌載量與野生株相比顯著下降(p<0.01)。
　　綜上所述,研究的結(jié)果表明,TbdR1在鴨疫里氏桿菌CH3株的獲鐵(如hemin)過程中起著重要的作用,而且與CH3株的致病性相關(guān)。因此,