鴨疫里默氏桿菌致病相關因子研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌是一個多宿主的病原菌，除主要引起家鴨的滲出性炎癥以外，還感染鵝、雞、火雞、鴿子、野鴨、鸚鵡等其它鳥類，甚至已從豬、青魚體內(nèi)分離鑒定出該細菌。目前鴨疫里默氏桿菌已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病原之一，呈世界性流行趨勢，發(fā)病率和死亡率一般為10-30％，但部分鴨場達95％以上。該細菌的危害除引起動物發(fā)病、死亡外，還因感染耐過動物飼料轉(zhuǎn)化率低、生長發(fā)育遲緩造成嚴重的經(jīng)濟損失，甚至由于抗菌藥物的大量使用而引起食品安全問題。自1982年以來

2、，尤其是在東亞和東南亞地區(qū)，鴨疫里默氏桿菌感染嚴重制約了肉鴨的集約化養(yǎng)殖。 鴨疫里默氏桿菌血清型復雜，各血清型菌株間缺乏交叉免疫保護：極易產(chǎn)生耐藥性，流行菌株多表現(xiàn)為多重耐藥。關于其致病相關因子尚不明確，而對于致病機制的研究處于起步階段。作者在研究鴨疫里默氏桿菌液化明膠菌株的流行病學特征的過程中發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌液化明膠特性與致病性有關?；诖?，本文以液化明膠活性成分（明膠酶）為對象，研究鴨疫里默氏桿菌的致病相關因子，為進一步

3、研究細菌的致病機制奠定基礎。 1．鴨疫里默氏桿菌流行菌株的分離鑒定及液化明膠特性測定 利用巧克力營養(yǎng)瓊脂平板從2004-2008年收集于重慶、四川等25個地區(qū)的661份疑似鴨疫里默氏桿菌感染的自然病例中分離、鑒定出548株鴨疫里默氏桿菌，其中512株對10日齡鴨具有毒力，25株細菌經(jīng)鴨體內(nèi)傳1-3代后獲得毒力，11株在鴨體內(nèi)傳7代仍不具有毒力。利用明膠-營養(yǎng)瓊脂平板和明膠-瓊脂平板分別測定細菌及培養(yǎng)濾液的液化明膠特性，有

4、毒力的537株細菌及培養(yǎng)濾液都能液化明膠，占分離菌株的98％；不具有毒力的11株細菌及培養(yǎng)濾液不能液化明膠，占分離菌株的2％。鴨疫里默氏桿菌液化明膠特性穩(wěn)定，液化明膠和不液化明膠菌株在巧克力培養(yǎng)基和鴨體內(nèi)分別傳30和10代后未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。液化明膠的鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)濾液的明膠酶譜呈現(xiàn)6條活性帶，不同菌株各譜帶的活性存在差異，且各譜帶活性能被EDTA抑制。 2．鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)明膠酶的條件優(yōu)化及酶的分離純化 本研究在建

5、立定量測定鴨疫里默氏桿菌明膠酶活性的基礎上，對鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基本組成為2％蛋白胨、0．5％酵母粉和0．5％氯化鈉，初始pH值為7．4；培養(yǎng)基含終濃度5mMCa2+有利于酶的產(chǎn)生；最適培養(yǎng)溫度為37℃，在振蕩條件下的最適培養(yǎng)時間為24h。 在最佳條件下培養(yǎng)AF株細菌，培養(yǎng)濾液經(jīng)分子截流量為10kDa超濾膜濃縮、最終飽和度為70％硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flo

6、w陰離子交換層析、phenyl-sepharose CL-4B疏水柱層析及Superdex-75凝膠柱層析分離純化，獲得具有液化明膠活性的蛋白質(zhì)組分（明膠酶），活性回收率為28．4％。分離純化的明膠酶的比活力為17076．0U/mg：經(jīng)SDS-PAGE檢測為分子量59kDa單帶；明膠酶譜與培養(yǎng)濾液的第5活性條帶一致。 3．鴨疫里默氏桿菌明膠酶的生物學活性研究 本研究利用鴨胚成纖維細胞和10日齡雛鴨模型對分離純化的鴨疫里默

7、氏桿菌明膠酶的生物學活性進行了研究。明膠酶對鴨胚成纖維細胞具有細胞毒性，半數(shù)致死濃度（LG50）和半數(shù)生長抑制濃度（GI50）分別為1．45U/ml和0．16U/ml；導致細胞形態(tài)發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為細胞膜降解、細胞質(zhì)喪失與細胞核濃縮。對30株鴨疫里默氏桿菌臨床分離株的培養(yǎng)濾液檢測發(fā)現(xiàn)，具有毒力及能液化明膠的27株細菌均能引起與明膠酶一致的細胞形態(tài)變化，而無毒力及不液化明膠的3株細菌的培養(yǎng)濾液不表現(xiàn)細胞毒性。 明膠酶對雛鴨具有毒

8、性，能增強鴨疫里默氏桿菌對動物的侵襲力，增加菌血癥的嚴重程度，縮短感染潛伏期和致死動物的時間，顯著提高動物的死亡率。頸靜脈注射5000U/ml能致死10日齡雛鴨，2000U/ml能引起發(fā)病，而500U/ml的作用不明顯。發(fā)病動物主要表現(xiàn)嗜睡懶動、腿軟無力、甩頭、張口呼吸及頭頸歪斜等癥狀；死亡動物有肝臟輕微腫大、硬腦膜有出血點、大腦水腫等大體病理變化。在組織學上，2000U/ml作用8h鴨的心肌纖維腫脹變粗、橫紋不明顯，纖維間質(zhì)水腫、可見

9、微細顆粒和空泡；肝細胞索不規(guī)則，肝血竇變小，肝細胞腫脹、胞漿中出現(xiàn)大小不等的空泡；脾中央動脈內(nèi)皮細胞腫脹、脫落，脾小體局灶性出血及小淋巴管擴張，淋巴鞘數(shù)量增多、管徑擴大，淋巴細胞不同程度變性、壞死。在超微結(jié)構(gòu)上，心肌細胞線粒體腫大，毛細血管的內(nèi)皮細胞中多空泡、核膜不均一；肝細胞核濃縮、邊緣有皺褶，毛細血管內(nèi)皮細胞間連接不緊密、紅細胞形態(tài)不規(guī)則；脾淋巴細胞核膜不規(guī)則、染色質(zhì)核周邊濃集。 明膠酶經(jīng)靜脈注射后對雛鴨外周血血液指標的影響

10、明顯。雛鴨外周血中紅細胞（RBC）的數(shù)量與C3b花環(huán)率顯著下降，在9h最低，分別為（1．58±0．05）×1012·L-1和（18．5±1．32）％。白細胞（WBC）的數(shù)量減少；對綿羊紅細胞的吞噬率（BP）與吞噬指數(shù)（IP）降低，在6h時最低，分別為（27．7±2．0）％和1．053±0．015，與對照差異極顯著；對金黃色葡萄球菌的殺菌指數(shù)下降，在9h時最低為0．4562±0．0205，與對照差異極顯著。外周血中淋巴細胞（LT）數(shù)量減少

11、；a-醋酸萘酯酶陽性T淋巴細胞百分率降低。血清谷草/谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、堿性磷酸酶活性及總膽固醇和血清葡萄糖水平顯著升高。血清總補體活性（CH50）顯著下降。 明膠酶的作用對雛鴨脾臟損傷嚴重，導致脾淋巴細胞的增殖活性和生成IgG的能力下降，9h最低，分別為0．185±0．022和0．237±0．038，與對照差異極顯著；可引起雛鴨血．腦屏障機能障礙，表現(xiàn)為腦脊液中的白蛋白含量升高，血-腦屏障的通透性增大，基底膜粗糙、部分節(jié)段的連續(xù)性

12、中斷，腦血管周圍水腫、管腔面不光滑、內(nèi)皮細胞腫脹、連接處開放。 4．鴨疫里默氏桿菌明膠酶基因克隆及分析 從AF株培養(yǎng)濾液中分離純化的明膠酶N-氨基酸殘基序列為：天冬酰胺-蘇氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-組氨酸-甘氨酸（NTGAAEGTHG），在NCBI中未能找到同源序列，僅第3-10位氨基酸殘基與類鼻疽伯克霍爾德菌406e株的一個假設保守蛋白的第555-562一致。在此基礎上，以N端氨基酸序列設計

13、引物，用單特性引物PCR（SSP-PCR）從細菌基因組DNA文庫中克隆出197bp的DNA片段，然后利用熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）進行基因組步移，獲得2150bp核苷酸序列。該序列中有一個1872bp的ORF，編碼624aa，其中包含NTGAAEGTHG序列；1-24aa為信號肽；成熟蛋白存在3個跨膜區(qū)，分別在25-45aa、211-232aa和416-435aa；在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中未能找到同源性序列。 5．鴨疫里默氏

14、桿菌明膠酶的理化特性測定 鴨疫里默氏桿菌明膠酶不降解Ⅰ型膠原蛋白維、干酪素、牛血清白蛋白Ⅴ及Azocoll試劑；降解明膠的最適作用溫度和pH值分別為37℃和7．8，在4℃24h及37℃2h內(nèi)穩(wěn)定、65℃0．1h內(nèi)完全失活；Ca2+、Mg2+、Na+和Zn2+對酶有一定激活作用，Cu2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+及金屬離子絡合物EDTA和EGTA對酶活性有強烈的抑制作用，但絡合物的抑制作用可以被Ca2+逆轉(zhuǎn)：蛋白質(zhì)化學修飾劑2