鴨疫里氏桿菌保護(hù)性抗原的篩選及應(yīng)用.pdf

1、鴨疫里氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA），原名鴨疫巴氏桿菌（PasteurellaAnatipestifer，PA），原為巴氏桿菌科里氏桿菌屬的一員，后被劃入黃桿菌科，除了進(jìn)化上的特異性，另一個引起人們研究興趣的原因主要是該茵引起世界范圍內(nèi)雛鴨的一種重要傳染病——鴨傳染性漿膜炎。該病原菌主要引起雛鴨敗血癥，表現(xiàn)為腦膜炎、心包炎和腹膜炎等，導(dǎo)致養(yǎng)鴨業(yè)巨大經(jīng)濟損失。目前，已鑒定出的21種血清型，各血清型之間缺乏交

2、叉保護(hù)力是阻礙該病防控、疫苗研究和鑒別診斷的主要因素。市場上尚無安全、高效的疫苗用于該病原菌的防控。新型保護(hù)性抗原，特別是能為不同血清型菌株感染提供交叉保護(hù)力的交叉保護(hù)性抗原的篩選是研制新型亞單位疫苗的當(dāng)務(wù)之急。
　　2011年以來已有數(shù)株鴨疫里氏桿菌基因組被公布，這些基因組信息為高通量篩選保護(hù)性抗原開辟了新途徑。根據(jù)以往的報道和本實驗室分離保存的菌株統(tǒng)計，鴨疫里氏桿菌2型是臨床感染中危害最大的血清型之一，我們選擇2型代表毒株RA

3、f153進(jìn)行全基因測序，并建立了鴨疫里氏桿菌RAf153全菌蛋白的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用該方法共篩選到12種保護(hù)性抗原候選因子。
　　假定用一種血清型毒株人工感染雛鴨后制備的康復(fù)血清中存在其他血清型菌株抗原蛋白相應(yīng)的抗體，我們用抗RAf153鴨康復(fù)血清鴨疫里氏桿菌1型代表毒株RAf63及2型代表毒株RAf153的全菌蛋白和分泌蛋白進(jìn)行免疫蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定和肽指紋圖譜分析，最終篩選到16種RAf63的免疫反應(yīng)性蛋白和28

4、種RAf153的免疫反應(yīng)性蛋白，經(jīng)過比對分析，我們從中篩選到6種共同抗原，這些蛋白可作為交叉保護(hù)性抗原候選因子。對這些蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，并再次用抗RAf153鴨康復(fù)血清對融合蛋白進(jìn)行免疫反應(yīng)性分析，最終成功篩選到3種具有免疫反應(yīng)性的融合蛋白，用這3種蛋白進(jìn)行雛鴨攻毒保護(hù)試驗，結(jié)果顯示CR4(OmpA)對同源毒株及異源毒株感染均具有良好的保護(hù)力。免疫保守性分析結(jié)果顯示CR1可與1、2、10和13型血清發(fā)生免疫反應(yīng)，CR4與所有血清型均發(fā)生

5、免疫反應(yīng)，CR5可與1、2、10型血清發(fā)生免疫反應(yīng)。這些特異性蛋白對于鴨疫里氏桿菌的流行病學(xué)分析具有重要意義。
　　目前仍缺乏簡便高效的檢測方法用于鴨疫里氏桿菌不同血清型尤其是某些特定血清型菌株感染的檢測，本研究中利用篩選到的免疫保守性很好的外膜蛋白A(OmpA)和延伸因子G（EfG）初步建立起ELISA檢測方法。對收集到的465份出欄前鴨血清和30份種鵝血清進(jìn)行抗體檢測，結(jié)果顯示，南京周邊地區(qū)雛鴨血清OmpA抗體陽性率為48.8

6、％，種鵝為33.3％;其中1、2、10型占79.3％。利用GenBank上公布的16SrRNA基因信息設(shè)計引物建立起PCR檢測方法，從一個1萬羽養(yǎng)殖規(guī)模的鴨場隨機抽取10只表觀健康的出欄前肉鴨采集喉拭子進(jìn)行PCR檢測，從中檢出5個陽性結(jié)果;從另一萬羽鴨場收集10只比同齡鴨個體小、離群、腹瀉、精神萎靡、共濟失調(diào)的出欄前肉鴨，剖檢可見肝臟有出血點、心包纖維素性滲出，嚴(yán)重者內(nèi)臟與腹腔壁發(fā)生粘連，從腦部分離病原進(jìn)行燭缸培養(yǎng)，共分離出2株鴨疫里氏

7、桿菌，其中一株與大腸桿菌混合感染，兩株菌用玻片凝集試驗鑒定為2型菌株。說明南京周邊地區(qū)鴨場已呈現(xiàn)廣泛帶菌狀態(tài)。
　　對RAf153進(jìn)行全基因組測序（未公布），將其與已公布的1型菌株進(jìn)行比對后共篩選到長度為200bp～3000bp的特有片段共16處，選擇其中7處設(shè)計引物進(jìn)行型特異性鑒定，大部分引物可以區(qū)分1型和2型菌株，但是所有引物均能從本實驗室保存的其他血清型菌株中擴增出目的片段，因此尚無法用于鑒別診斷。
　　引物7擴增的片