牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護性抗原的篩選及其融合蛋白免疫效果的研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是巴氏桿菌屬最重要的致病菌，屬于革蘭氏陰性菌，能夠感染家養(yǎng)和野生動物，具有廣泛的宿主譜。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜血清型的不同分為A、B、D、E和F5種血清群，根據(jù)LPS抗原性的不同又可將其分為16種血清型。近年來，綜合國內(nèi)外報道我們發(fā)現(xiàn)引起肉牛多殺性巴氏桿菌病的主要血清型是A型和B型，而且A型多殺性巴氏桿菌疾病呈逐年上升趨勢。目前，預(yù)防牛源巴氏桿菌病的疫苗主要是針對B型多殺

2、性巴氏桿菌的滅活疫苗，雖然該類疫苗在控制牛源巴氏桿菌病中起到了重要的作用，但是對不同血清型的交叉保護性弱。因此，需要開發(fā)一種安全有效，并能提供交叉保護性的新型疫苗來預(yù)防多殺性巴氏桿菌疾病，而牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護性抗原的篩選，為該新型融合疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ompA、ompH、PlpE、pm0979、P6以及pfhB6種抗原能對單一血清型提供一定的保護率，而且，在多種血清型中保守性極高。但是，在這些成

3、分中哪些能提供交叉保護性作用還是未知。因此，本研究以這6種抗原基因作為研究對象，在相同免疫劑量與攻毒劑量的前提下，進行了如下研究:
　　1、牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護性抗原的初步篩選
　　以牛源A型Pm CQ2株基因組為模板，利用PCR技術(shù)對6種保護性抗原基因進行擴增，構(gòu)建相應(yīng)的原核表達載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21進行表達，同時對表達產(chǎn)物進行純化以及Western blot鑒定。用純化后的蛋白皮下免疫小鼠，于二免21 d

4、后，用ELISA法檢測小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況，并用2 LD50 Pm CQ2株(4.4×105cfu)、PmB型（2.96×104 cfu）腹腔攻毒，計算小鼠存活率。結(jié)果顯示，rPM0979、rPLPE以及rOMPH三種蛋白對A型和B型多殺性巴氏桿菌均提供了良好的保護性，其中對PmA型保護率分別為40％、70％、60％，對PmB型保護率分別為30％、40％、30％。結(jié)果提示，蛋白rPM0979、rPLPE以及rOMPH具有交叉保護性，可作

5、為后續(xù)研制融合疫苗的潛在蛋白。
　　2、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-ompH融合基因的表達及其表達產(chǎn)物的交叉保護性研究
　　通過生物信息學(xué)分析獲得pm0979、ompH基因的主要抗原表位片段，并將兩個基因片段用3種不同長度的疏水性linker進行拼接融合（標記為pm0979-L6-ompH、pm0979-L10-ompH、pm0979-L15-ompH）。對融合基因進行表達，并對表達的蛋白進行純化及Western blo

6、t分析，最終以rPM0979、rOMPH、rPM0979-L6-OMPH、rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH蛋白免疫小鼠后進行Pm CQ2株、PmB型攻毒試驗，分別測定小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況以及對小鼠的交叉保護性效果。結(jié)果顯示，表位基因表達的單一蛋白的交叉保護性與之前的全長基因表達的蛋白相比較，其交叉保護性有所降低，但融合蛋白的相對來說都有所提高;其中，融合蛋白rPM0979-L6-OMPH對Pm CQ2株

7、攻毒的小鼠保護率為60％，對PmB型攻毒小鼠保護率為20％，融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH對Pm A型攻毒的小鼠保護率為70％，對PmB型攻毒小鼠保護率為30％。結(jié)果提示，3種rPM0979-OMPH融合蛋白對小鼠具有良好的交叉保護性，其中融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH交叉保護性效果較好;同時該結(jié)果還提示，不同linker長度的融合蛋白對小鼠的保護率

8、不同，而且linker的最佳長度為10aa。
　　3、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-PlpE融合基因的表達及其表達產(chǎn)物的交叉保護性研究
　　通過生物信息學(xué)分析獲得了pm0979、PlpE基因的主要抗原表位，將pm0979、PlpE基因通過長度為10aa的linker相連，構(gòu)建融合基因pm0979-L10-PlpE。對融合基因進行表達，并對表達的蛋白進行純化及Western blot分析。通過小鼠試驗評價重組蛋白rPM097