牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因篩選及初步分析.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）常引起牛出血性敗血癥、牛肺炎、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、山羊和綿羊肺炎等多種動(dòng)物疾病，人類受到攜帶病原的動(dòng)物咬傷或者抓傷也會(huì)引發(fā)感染。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜血清型的不同分為A、B、D、E和F5種血清群，根據(jù)脂多糖抗原的不同分為16種血清型。自2008年我國(guó)首次分離到牛源A型多殺性巴氏桿菌以來(lái)，該病原常與其他病原菌繼發(fā)感染，在多地牛群中呈現(xiàn)流行性發(fā)生，感染該病菌的牛出現(xiàn)高發(fā)病率

2、和死亡率，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　多殺性巴氏桿菌根據(jù)其對(duì)宿主致病力的不同，分為強(qiáng)毒力菌株和弱毒力菌株，影響菌株毒力的主要因素是編碼毒力因子的毒力基因以及相關(guān)調(diào)控基因，強(qiáng)弱毒株基因組序列的比較可為菌株致病性研究提供許多有用信息，強(qiáng)毒株中存在，弱毒株中不存在的差異基因往往在細(xì)菌致病機(jī)理中占有重要作用。研究表明，毒力基因表達(dá)的蛋白作為抗原制備疫苗免疫動(dòng)物，可以對(duì)機(jī)體起到免疫保護(hù)作用。抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）是目前應(yīng)用成熟的

3、一種技術(shù)，常用于致病菌與非致病菌差異基因篩選，將其基因組共同的部分去除，提煉更有價(jià)值的信息。本研究通過(guò)SSH技術(shù)對(duì)強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2和弱毒株P(guān)mCQ6基因組進(jìn)行消減雜交，試圖獲得可能具有致病性或調(diào)控毒力基因表達(dá)的候選基因序列片段；然后結(jié)合對(duì)強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選可能的差異基因候選分子，通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證并進(jìn)一步比對(duì)分析；最后對(duì)差異基因克隆表達(dá)，選擇蛋白表達(dá)量高且反應(yīng)原性好的分子做初步研究。具體內(nèi)容及結(jié)果如下：
　

4、　1、牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的SSH法篩選
　　以本實(shí)驗(yàn)室保存的牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2和弱毒株P(guān)mCQ6為研究對(duì)象，利用抑制性消減雜交技術(shù)研究強(qiáng)弱毒株差異基因。結(jié)果表明：PmCQ2和PmCQ6基因組DNA酶切完全，通過(guò)消減雜交富集了差異基因片段，成功構(gòu)建差減文庫(kù)并對(duì)其基因進(jìn)行T克隆，菌液PCR結(jié)果顯示117個(gè)陽(yáng)性克隆獲得了插入片斷，測(cè)序和基因生物信息學(xué)分析后獲得28個(gè)差異基因，將差異基因按照編碼的蛋

5、白功能不同分為五類：毒力因子相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白、DNA合成相關(guān)蛋白、其他相關(guān)蛋白。研究結(jié)果為牛源 A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的篩選以及致病性基因的深入探討奠定了分子基礎(chǔ)。
　　2、牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析及PCR驗(yàn)證
　　SSH法分析獲得的強(qiáng)弱毒株28個(gè)差異基因片段與牛源 A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株和PmCQ6株的全基因組序列本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到1個(gè)只存在于Pm

6、CQ2基因組的差異基因PmCQ2-6g0023，編碼噬菌體尾巴蛋白，與弱毒株的對(duì)應(yīng)基因PmCQ6-8g0001序列相比，PmCQ2-6g0023基因缺失了30個(gè)堿基。
　　根據(jù)公司對(duì)強(qiáng)弱毒株基因組生物信息學(xué)分析結(jié)果，從理論上得到46個(gè)差異基因，這些基因數(shù)量多且差異性還待進(jìn)一步驗(yàn)證。前期研究表明噬菌體相關(guān)基因在巴氏桿菌中常成簇存在，并且會(huì)影響菌株的致病力，推測(cè) PmCQ2-6g0023的上下游基因以及與噬菌體相關(guān)的其他基因也存在差異

7、性。本試驗(yàn)基于以上的研究和推測(cè)，參照公司分析得到的46個(gè)差異基因，從中篩選了7個(gè)噬菌體相關(guān)基因、1個(gè)PmCQ2-6g0023上游基因PmCQ2_6g0019、1個(gè)可能編碼毒力因子Gp63或假定蛋白的基因PmCQ2_6g0001等共9個(gè)基因，還有PmCQ2-6g0023，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其在強(qiáng)弱毒株中的差異性。
　　結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室分離保存的強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2、PmCQ1、PmCQ3、PmCQ4、PmCQ5以及PmCQ7與弱

8、毒株P(guān)mCQ6的差異基因共8個(gè)，分別是PmCQ2_2g0233、PmCQ2_2g0235、 PmCQ2_5g0023、 PmCQ2_6g0001、 PmCQ2_6g0006、PmCQ2_6g0018、PmCQ2_6g0019、PmCQ2_6g0021。PmCQ2-6g0023也可以從其他5個(gè)強(qiáng)毒株中擴(kuò)增得到。差異基因中編碼的蛋白注釋結(jié)果有7個(gè)與噬菌體相關(guān)（包括PmCQ2-6g0023），證明了推測(cè)的正確性。
　　3、牛源 A型多殺

9、性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因 PmCQ2-6g0018的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究
　　選取以上研究獲得的9個(gè)差異基因以及PmCQ6-8g0001，通過(guò)PCR克隆差異基因全長(zhǎng)，分別插入原核表達(dá)載體 pET-30a（+），經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，4個(gè)重組目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)且與預(yù)期分子大小一致。選擇其中蛋白注釋功能為噬菌體尾巴蛋白，且表達(dá)量高的rPmCQ2-6g0018和rPmCQ2-6g002

10、1重組蛋白，大量誘導(dǎo)表達(dá)后，用Ni柱對(duì)目標(biāo)融合蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白rPmCQ2-6g0018分子量大小約19 KDa且具有良好的免疫活性。
　　從轉(zhuǎn)錄水平分析基因 PmCQ2-6g0018在體內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在16h時(shí)間點(diǎn)，PmCQ2-6g0018在小鼠肺臟中相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組。
　　將純化蛋白 rPmCQ2-6g0018和全菌蛋白分別免疫小鼠（免疫劑量為100μg/只）