禽多殺性巴氏桿菌PtfA基因殼聚糖納米DNA疫苗的研究.pdf

1、禽多殺性巴氏桿菌是引起食源性動(dòng)物呼吸道感染的一種重要的病原菌，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，控制禽巴氏出血癥的疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗。但這些傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效果并不理想。DNA疫苗制備方便、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可在動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答。殼聚糖是一種生物可降解性的天然多糖，可保護(hù)DNA免受核酸酶的降解，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有巨大的潛力。因此殼聚糖DNA納米疫苗成為當(dāng)前DNA疫苗的研究熱點(diǎn)。
　　本文以該基因?yàn)檠芯繉?duì)象，

2、通過(guò)PCR擴(kuò)增該基因，采用BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，并將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建并擴(kuò)增該重組質(zhì)粒，與0.02％的殼聚糖溶液混合，通過(guò)復(fù)凝聚法制備殼聚糖-PtfA納米疫苗。采用凝膠阻滯試驗(yàn)、透射電鏡觀察，確定最佳N/P比；將該疫苗免疫小鼠，間接 ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體水平、MTT法外周血淋巴細(xì)胞增殖率、試劑盒法測(cè)定IFN-γ分泌水平及該疫苗的免疫保護(hù)率。試驗(yàn)結(jié)果表明，以 N/P比為2.5制備的殼聚糖-pcDNA3

3、.1(+)/PtfA納米顆粒，85%的顆粒呈規(guī)則的球狀，包封率高、大小均一，其粒徑在200nm左右；免疫后，殼聚糖-重組質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組小鼠血清抗體水平、淋巴細(xì)胞增殖率含量顯著高于生理鹽水組、空載體組及其殼聚糖復(fù)合物組（p<0.01），且殼聚糖-重組質(zhì)粒組略高于重組質(zhì)粒組；這兩組 IFN-γ含量分別達(dá)到了359.31ng/L、310.14ng/L，極顯著高于另外三組；攻毒后，殼聚糖-重組質(zhì)粒組的免疫保護(hù)率達(dá)到了75%，顯著高于其它四組