牛源A型多殺性巴氏桿菌PM0979蛋白的功能研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）為球桿狀或短桿狀的革蘭氏陰性菌，根據(jù)莢膜抗原主要分為A、B、D、E和F5種莢膜血清型，根據(jù)菌體抗原分為1～16個(gè)血清型。多殺性巴氏桿菌能夠引起牛羊等多種動(dòng)物的感染，導(dǎo)致急慢性傳染性疾病，其癥狀包括牛出血性敗血癥、牛肺炎、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂、兔出血性敗血癥等。已有文獻(xiàn)報(bào)道，人被犬貓抓傷后感染多殺性巴氏桿菌可引起局部組織損傷，甚至導(dǎo)致全身系統(tǒng)性疾病。該病不僅嚴(yán)重威脅

2、動(dòng)物及人類的身體健康，也給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著肉牛養(yǎng)殖的發(fā)展，牛多殺性巴氏桿菌病的流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而牛群感染大多以A型多殺性巴氏桿菌所致的牛肺炎為主。
　　多殺性巴氏桿菌毒力因子在致病機(jī)制中占有至關(guān)重要的作用，如粘附素、莢膜、脂多糖、外膜蛋白、鐵調(diào)控蛋白和毒素等。外膜蛋白是外膜中鑲嵌的多種蛋白質(zhì)的總稱，脂蛋白是外膜蛋白的一種，具有粘附宿主、抵御毒素入侵、影響生物膜形成等作用，在細(xì)菌對(duì)宿主的感染和致病過程中起著重

3、要的作用。根據(jù)報(bào)道，脂蛋白E（PlpE）作為重要的毒力因子，具有較好的免疫原性，可作為良好的疫苗候選。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PM0979蛋白可能是細(xì)胞膜的組成成分，且其重組蛋白具有較好的免疫原性，但目前對(duì)其功能的研究尚不清楚。本研究首先通過生物信息學(xué)軟件分析PM0979的蛋白結(jié)構(gòu)和可能的細(xì)胞定位；同時(shí)，采用熒光定量PCR檢測(cè)Pm0979基因的體內(nèi)外表達(dá)情況。其次，通過間接免疫熒光分析其細(xì)胞定位。最后，通過體外實(shí)驗(yàn)研究其刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥

4、細(xì)胞因子的能力；同時(shí)，以A型多殺性巴氏桿菌為研究對(duì)象，構(gòu)建Pm0979基因的突變株，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步探究其功能。
　　1.多殺性巴氏桿菌pm0979基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)外表達(dá)差異分析
　　本試驗(yàn)利用 SignalP-4.1 server及 TMHMM Server v2.0在線分析軟件對(duì)PM0979進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，PM0979蛋白的1-20aa為信號(hào)肽區(qū)域，無跨膜結(jié)構(gòu)域；利用DOLOP在

5、線分析程序以及LipoP1.0 server在線分析軟件對(duì)PM0979蛋白進(jìn)行脂蛋白的預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)其為假定的脂蛋白；利用CELLOv.2.5在線分析軟件進(jìn)行Pm0979基因細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果該蛋白定位在細(xì)胞膜與外膜之間；利用 Clustalx1.83分析軟件進(jìn)行 Pm0979基因的同源性分析比較，結(jié)果顯示，基因 Pm0979在A型菌株和B型菌株中保守性極高，在D型菌株、F型菌株和羊源菌株中存在單堿基的突變，提示PM0979蛋白定

6、位在胞外且與巴氏桿菌多種血清型菌株同源性高。在以上結(jié)果基礎(chǔ)上，以本實(shí)驗(yàn)室不同血清型菌株 PmA、PmB、PmF為模板，通過熒光定量 PCR檢測(cè)Pm0979基因的體外表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Pm0979基因在 PmA、PmB、PmF型菌株的體內(nèi)外均表達(dá)且有一定差異。
　　2. Pm0979基因的原核表達(dá)及其蛋白的細(xì)胞定位分析
　　通過設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增PmCQ2菌株的Pm0979基因，以PET-32a（+）為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，IP

7、TG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rPM0979。通過超聲波破碎菌體后保留上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及可溶蛋白rPM0979的純化除鹽，制備rPM0979的小鼠血清抗體。以PmCQ2為研究對(duì)象，通過間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)PM0979蛋白在PmCQ2菌株中的分布特征。結(jié)果顯示透化組的PmCQ2呈現(xiàn)翠綠色熒光信號(hào)，未透化組和陰性組的PmCQ2沒有任何信號(hào)，表明rPM0979抗體能夠特異地識(shí)別Pm細(xì)胞壁內(nèi)的抗原，并與之發(fā)生免疫反應(yīng)，推測(cè)該蛋白可

8、能分布于細(xì)菌的膜上。
　　3.多殺性巴氏桿菌PM0979致病性研究
　　分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并將可溶蛋白rPM0979與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24h，通過ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，rPM0979誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細(xì)胞因子均上調(diào)，TNF-α、IL-6及IL-18的上調(diào)與對(duì)照組相比差異極顯著，IL-1β差異顯著。該結(jié)果提示PM097

9、9可能參與多殺性巴氏桿菌致炎作用。
　　以PmCQ2基因組為模板PCR擴(kuò)增Pm0979基因的上下游同源臂，將其克隆至質(zhì)粒PUC19oriKanR相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PUC19oriKanR-△0979。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，PCR檢測(cè)及Western blot驗(yàn)證，構(gòu)建PmCQ2菌株的Pm0979基因突變株。檢測(cè)突變株對(duì)生化試驗(yàn)，生長(zhǎng)曲線，生物膜形成的影響。結(jié)果顯示，PmCQ2-△09

10、79突變株與野毒株P(guān)mCQ2的生化特性一致；體外37℃培養(yǎng)，PmCQ2-△0979突變株生長(zhǎng)速度與野毒株 PmCQ2無差異；值得注意的是，PmCQ2-△0979突變株生物膜形成能力減弱；同時(shí)，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PM0979對(duì)巴氏桿菌毒力的影響，動(dòng)物攻毒試驗(yàn)顯示，PmCQ2-△0979突變株腹腔攻毒小鼠后死亡率為75%，而野生型PmCQ2為100%。說明PmCQ2-△0979突變株毒力減弱；ELISA檢測(cè)PmCQ2-△0979突變株感