牛分枝桿菌主要保護(hù)性抗原基因的克隆、表達(dá)及免疫研究.pdf

1、牛結(jié)核病(Bovinetuberculosis)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人獸共患傳染病，該病的流行與傳播不僅嚴(yán)重地影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且也嚴(yán)重地威脅和危害著人類的生命與健康，被國際獸疫局(OIE)列為B類傳染病。人結(jié)核病的10％以上是由牛分枝桿菌引起的。近年來，人結(jié)核病在世界范圍內(nèi)大幅回升，每年死亡人數(shù)高達(dá)300萬，是其它傳染病死亡人數(shù)之和，當(dāng)屬傳染病之魁首。由于牛結(jié)核病的存在，致使人結(jié)

2、核病最終無法根除。近年來，牛結(jié)核病在全球范圍內(nèi)也呈上升趨勢，尤其是在廣大的發(fā)展中國家流行嚴(yán)重，我國牛結(jié)核的陽性檢出率為10％左右。在牛結(jié)核病的預(yù)防上，目前唯一可用的疫苗就是卡介苗(BCG)，但是接種BCG后免疫效果不確定，同時還干擾牛PPD的變態(tài)反應(yīng)檢測，無法區(qū)別是自然感染還是人工免疫，給日常檢疫工作帶來了相當(dāng)?shù)睦щy。因此研發(fā)牛結(jié)核病的新型診斷和預(yù)防制劑已成為控制牛結(jié)核病的研究熱點(diǎn)。 結(jié)核分枝桿菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體抵抗結(jié)核分枝

3、桿菌的感染主要依靠細(xì)胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中存在的大量分泌蛋白能有效地誘發(fā)對結(jié)核分枝桿菌的抵抗性，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，因此分泌蛋白是保護(hù)性抗原。DNA疫苗能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白抗原通過MHCⅠ類分子呈遞抗原，激活CTL及殺滅靶細(xì)胞是DNA疫苗發(fā)揮保護(hù)作用的最主要機(jī)制之一，這正是抗結(jié)核感染所必需的。另有研究指出，DNA疫苗免疫后，不干擾結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)檢測。為了研制

4、牛結(jié)核病敏感、特異的診斷試劑和新型、高效的預(yù)防制劑，尤其是DNA疫苗，本研究進(jìn)行了以下幾方面的工作： 1、牛分枝桿菌主要保護(hù)性抗原基因的克隆篩選了M.bovisAg85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七種分泌蛋白的保護(hù)性抗原基因。以M.bovisVallee1ll染色體DNA為模板，以Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6成熟蛋白基因特異性

5、引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出888bp、858bp、801bp、390bp、492bp、603bp和288bp的DNA片段。通過T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-TVector中，以α-互補(bǔ)法、質(zhì)粒大小鑒定、酶切鑒定、PCR鑒定及序列分析鑒定重組克隆，成功地構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6。序列

6、測定及同源性分析表明，所獲得的M.bovisVallee111成熟蛋白基因與M.bovis中其它菌株相應(yīng)基因具有高度的同源性。 2、主要保護(hù)性抗原基因的原核表達(dá)為了獲得M.bovis七個保護(hù)性抗原基因的表達(dá)產(chǎn)物，將克隆質(zhì)粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6中的Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB7

7、0、MPB83和ESAT-6基因分別亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a及pGEX-4T-3中，分別構(gòu)建出原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-85A、pET28a-85B、pET28a-51、pET28a-63、pET28a-70、pET28a-83及pGEX-4T-3-ESAT-6。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析，分別獲得了32kDa、30kDa、30kDa、18kDa、25kDa、26

8、kDa和34kDa的融合目的蛋白。Westernblot分析表明，所表達(dá)的目的蛋白均具有牛分枝桿菌的抗原性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，只有MPB63主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)，而其它目的蛋白則主要以包涵體的形式表達(dá)。采用冰浴超聲波裂解法破碎細(xì)菌，經(jīng)TritonX-100的緩沖液反復(fù)洗滌，制備包涵體，通過SDS-PAGE對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行了純化，再經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，純化的目的蛋白僅表現(xiàn)為單一條帶，從而作為真核重組表達(dá)質(zhì)粒免疫效果的檢測抗原。

9、 3、主要保護(hù)性抗原基因的真核表達(dá)為了構(gòu)建DNA疫苗，將克隆質(zhì)粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6中的Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6基因分別亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中，成功地構(gòu)建出真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-85A、pVAX1-85B、pVAX1-51、p

10、VAX1-63、pVAX1-70、pVAX1-83及pVAX1-ESAT-6。以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將真核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，通過熒光抗體技術(shù)和RT-PCR技術(shù)證實目的基因在哺乳動物細(xì)胞中獲得了表達(dá)。 4、真核重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫研究為研究真核重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫特性，以pVAX1-85A、pVAX1-85B、pVAX1-51、pVAX1-63、pVAX1-70、pVAX1-83、pVAX1-ESAT-6單個質(zhì)粒和pVAX

11、1-85B、pVAX1-70、pVAX1-83及pVAX1-ESAT-6四個質(zhì)粒聯(lián)合分別對BALB/c小鼠進(jìn)行了免疫，同時設(shè)pVAX1、生理鹽水和BCG對照組。間接ELISA檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83、ESAT-6抗原的特異性抗體，抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而升高，而且聯(lián)免組的體液免疫水平顯著地高于單免組(P＜0.05)，但仍不及BCG對照組，這一結(jié)果并未達(dá)

12、到國外報道的那樣“多價聯(lián)合DNA疫苗比活的BCG誘導(dǎo)的保護(hù)作用更為強(qiáng)烈”。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果表明，除pVAX1-85A免疫組外，其它重組質(zhì)粒免疫組均產(chǎn)生了相當(dāng)于BCG或略高于BCG水平的細(xì)胞免疫。CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒免疫組均產(chǎn)生了明顯(聯(lián)免組)或顯著的以CD8+T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫(P＜0.05)，說明重組質(zhì)粒DNA在攝取的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白抗原主要通過MHCⅠ類分子呈遞抗原，激活CD8+T細(xì)胞，表現(xiàn)出較強(qiáng)的

13、CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中pVAX1-51表達(dá)的蛋白抗原還可以通過MHCⅡ類分子呈遞抗原，激活CD4+T細(xì)胞，表現(xiàn)出更高的細(xì)胞免疫水平。另外，以pVAX1-70、pVAX1-83單個質(zhì)粒和pVAX1-70、pVAX1-83兩個質(zhì)粒聯(lián)合分別對豚鼠進(jìn)行了免疫，同時設(shè)pVAX1和BCG對照組。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒免疫組均產(chǎn)生了相當(dāng)于BCG或高于BCG水平的細(xì)胞免疫，這一結(jié)果與小鼠免疫結(jié)果一致。牛PPD皮試結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒

14、免疫組與BCG組差異極顯著(P＜0.01，P=0.0001)，表明重組質(zhì)粒免疫并不干擾牛PPD變態(tài)反應(yīng)檢測，這一結(jié)果與國外報道的研究結(jié)果一致。 上述研究結(jié)果表明，本研究獲得了M.bovisAg85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七個保護(hù)性抗原基因的原核表達(dá)產(chǎn)物，為研究其免疫生化特性及作為新型診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。構(gòu)建的真核表達(dá)載體，在實驗動物體內(nèi)均產(chǎn)生了特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫。為進(jìn)一