表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌的構(gòu)建.pdf

1、由產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(Shiga-like toxigenic Escherichia coli,SLTEC)引起的斷奶仔豬腹瀉(Post-weaningdiarrhoea,PWD)和仔豬水腫病(Edemadisease,ED)是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染病.該研究構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌,并對其免疫力進(jìn)行初步評(píng)估.該研究利用PCR技術(shù),分別從大腸桿菌TB1、107/86和C83907菌株中擴(kuò)增出不

2、含信號(hào)肽序列的Stx 2e B亞單位基因(stx2eB)、F18菌毛的A亞單位基因(fedA)和F4菌毛亞單位基因(faeG),并克隆入pGEM-T easy載體中,根據(jù)藍(lán)白斑篩選及限制酶酶切分析得到分別含有stx2eB、fedA和faeG基因的重組質(zhì)粒pstx2eB、pfedA和pfaeG.對重組質(zhì)粒中插入的片段進(jìn)行序列測定,結(jié)果表明插入的序列與公開發(fā)表的序列完全一致.再將各目的基因,按預(yù)定閱讀框架依次亞克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6

3、P-1的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游,對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFSFaeG進(jìn)行酶切分析和核苷酸序列分析,結(jié)果表明插入的片段與預(yù)期一致,且閱讀框正確.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后,在37℃、IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá).通過對重組大腸桿菌的菌體裂解物的SDS-PAGE電泳分析及Western-blot鑒定,表明重組菌能正確表達(dá)GST-FedA-Stx2eB-FaeG融合蛋白,即Stx2eB-FedA-FaeG蛋白與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶相連組成的

4、融合蛋白.用重組菌口服和肌注免疫31~35日齡的仔豬,通過對實(shí)驗(yàn)豬免疫后3d、7d、10d、14d糞檢菌的抗氨芐青霉素試驗(yàn)及對其進(jìn)行質(zhì)粒酶切分析,結(jié)果顯示該重組菌能穩(wěn)定地定居于仔豬腸道至少14d,用間接ELISA方法對免疫后7d、14d、31d和40d仔豬糞樣和血清中針對F4抗原的特異性IgA以及血清中針對F4抗原/F18抗原的特異性IgG進(jìn)行檢測.雖然糞樣和血清中一直未能測得針對F4抗原的特異性IgA,但通過對血清中針對F4抗原的特異