腸道外致病性大腸桿菌免疫保護(hù)性抗原的篩選及其脂多糖抗溶菌酶的機(jī)制.pdf

1、大腸埃希菌俗稱大腸桿菌，是一類在自然界中廣泛分布的革蘭陰性菌。根據(jù)其致病性及致病機(jī)理的不同，大腸桿菌被劃分為共生型大腸桿菌(Commensal Escherichiacoli)、腸道致病性大腸桿菌(Intestinal pathogenic Escherichia coli，IPEC)以及腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)。腸道外致病性大腸桿菌是一類

2、機(jī)會(huì)致病菌，長(zhǎng)期地?zé)o癥狀地定殖于宿主腸道中。當(dāng)宿主環(huán)境適宜時(shí)，能引起宿主的腸道外感染。ExPEC主要包括禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC)、致新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis-associatedEscherichia coli，NMEC)以及尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)。APEC可引起

3、多種家禽的急性或慢性感染，導(dǎo)致全身、多組織器官的病變。人源ExPEC可以導(dǎo)致新生兒腦膜炎以及尿道感染。ExPEC潛在的人畜共患性嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康，加強(qiáng)對(duì)ExPEC防控的研究，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生均具有重要的意義。
　　在ExPEC的防控中目前存在著兩個(gè)難題。首先，依賴于抗生素的防控造成了大腸桿菌耐藥菌株的涌現(xiàn)以及抗生素殘留問題，需要新的替代方法。大腸桿菌血清型眾多，疫苗間交叉保護(hù)力弱，限制了疫苗免疫防控手段的開展。其次， E

4、xPEC的致病機(jī)理不清楚。與IPEC相比，在致病過程中，ExPEC面臨的環(huán)境更加復(fù)雜，需要躲避更多的宿主天然免疫系統(tǒng)的殺傷機(jī)制。目前雖然在ExPEC中鑒定出大量的毒力相關(guān)因子，但是這些毒力因子在致病過程中的作用仍然不是十分清楚。而關(guān)于ExPEC抵抗宿主天然免疫系統(tǒng)的機(jī)制更是知之甚少。本研究一方面試圖通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選ExPEC保護(hù)性抗原，并對(duì)其作為亞單位疫苗的可能性進(jìn)行評(píng)估，另一方面通過轉(zhuǎn)座子突變文庫以及基因缺失技術(shù)，研究ExPEC

5、躲避宿主天然免疫系統(tǒng)中溶菌酶殺傷作用的機(jī)制。
　　1.APEC臨床分離株的毒力評(píng)估
　　根據(jù)菌株分離的時(shí)間和地點(diǎn)，從2007年～2011年在南京周邊地區(qū)等地分離的467株鴨源APEC臨床分離株中，挑取32株菌株作為代表菌株。通過新生SD大鼠細(xì)菌性腦膜炎模型，對(duì)這些菌株的毒力以及跨血腦屏障的能力進(jìn)行了檢測(cè)。并且利用PCR方法，從種系發(fā)育群和毒力因子分布兩方面對(duì)受測(cè)菌株的分子特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:各APEC菌株對(duì)新生SD大鼠的

6、致死率從0％～100％不等，菌株間毒力差異較大。其中，有26株菌株能夠從新生SD大鼠的腦脊液中重新分離獲得，說明這些菌株具有穿透血腦屏障的能力。種系發(fā)育群分析發(fā)現(xiàn)，所有8株B2群菌株均能跨過血腦屏障，且其中4株菌株對(duì)新生大鼠的致死率接近100％，提示B2群菌株毒力更強(qiáng)，更易導(dǎo)致腦膜炎的發(fā)生。在毒力因子分布試驗(yàn)中，僅hlyA未在受測(cè)菌株中擴(kuò)增出目的條帶，其他基因均有分布。Cnf1/2的檢出率最低，在1株不具有穿透血腦屏障的APEC菌株中檢

7、出。GimB和neuC是NMEC重要的毒力因子，檢出率分別為9.375％和12.5％，分布于具有穿透血腦屏障的APEC菌株中，提示它們可能在APEC跨血腦屏障的過程中也發(fā)揮重要的作用。在檢測(cè)的16個(gè)毒力相關(guān)因子中，14個(gè)基因分布于菌株DE205B。該菌株將作為研究APEC免疫保護(hù)性抗原的研究對(duì)象。
　　2.APEC免疫保護(hù)性抗原的篩選及免疫效果的評(píng)價(jià)
　　大腸桿菌血清型眾多，疫苗的交叉保護(hù)力差，成為大腸桿菌疫苗研發(fā)的一個(gè)難題

8、。為了尋找具有交叉保護(hù)力的亞單位疫苗，免疫蛋白質(zhì)組學(xué)以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)被運(yùn)用于APEC的免疫保護(hù)性抗原的篩選。提取APEC菌株DE205B(O2∶K1)的全菌蛋白，經(jīng)二維電泳分離后，與鴨抗DE205B高免血清反應(yīng)。結(jié)果鑒定出14個(gè)具有免疫反應(yīng)性的蛋白點(diǎn)，分別代表11個(gè)不同的蛋白，包括外膜蛋白A(OmpA)和鞭毛蛋白(FliC)兩個(gè)已知的免疫原。分子伴侶家族成員GroEL和另外8個(gè)蛋白是首次在

9、APEC中發(fā)現(xiàn)的具有免疫反應(yīng)性的蛋白。通過體外表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)了9個(gè)基因的重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示，7個(gè)重組蛋白能夠與鴨抗DE205B高免血清反應(yīng)，其中重組蛋白GroEL、OmpA和FliC顯示出較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與已知的免疫原性蛋白OmpA和FliC一樣，重組蛋白GroEL能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體，有一定的交叉免疫保護(hù)力。因此，GroEL可能是一種理想的免疫原，可作為APEC亞單

10、位疫苗的候選對(duì)象。
　　3.NMEC抗溶菌酶相關(guān)基因的篩選及缺失株的構(gòu)建
　　致新生兒腦膜炎大腸桿菌屬于腸道外致病性大腸桿菌，是導(dǎo)致新生兒細(xì)菌性腦膜炎最主要的革蘭陰性致病菌。在致病過程中，NMEC需要躲避宿主的先天免疫系統(tǒng)，在宿主的血液中存活并且增殖。溶菌酶是先天免疫系統(tǒng)中重要的防御物質(zhì)之一，廣泛的分布于宿主各組織細(xì)胞中，發(fā)揮著抵抗病原微生物入侵和清除入侵病原菌的作用。近年來雖然多種大腸桿菌溶菌酶抑制因子被發(fā)現(xiàn)，但是大腸桿菌

11、逃避溶菌酶介導(dǎo)的殺傷作用的機(jī)制仍然不是十分清楚。因此，本試驗(yàn)利用PUT mini-Tn5 Km質(zhì)粒，構(gòu)建了一個(gè)含有15000個(gè)轉(zhuǎn)座子突變株的突變文庫用以篩選抗溶菌酶菌株NMEC38中與溶菌酶抗性相關(guān)的基因。結(jié)果鑒別出25個(gè)突變株，分別代表20個(gè)基因。其中，14個(gè)基因編碼多種生物合成相關(guān)的酶，包括多糖的合成;1個(gè)基因編碼DctM家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;1個(gè)基因編碼PTS依賴的二羥基丙酮激酶操縱子調(diào)節(jié)蛋白;其余4個(gè)基因編碼多個(gè)假定蛋白，具體功能未知。

12、在這些轉(zhuǎn)座子突變株中，菌株F172對(duì)溶菌酶敏感性最高。對(duì)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，包括F172在內(nèi)的9個(gè)菌株（代表6個(gè)基因）的插入位點(diǎn)均位于galF至gnd基因簇之間。利用入red同源重組方法構(gòu)建了galF至gnd基因簇內(nèi)溶菌酶抗性相關(guān)基因的缺失株并進(jìn)行了特性分析，結(jié)果顯示與野生株相比，缺失株對(duì)溶菌酶的抗性均顯著下降，且外膜的通透性也有不同程度的增加。
　　4.NMEC脂多糖抑制溶菌酶活性的鑒定及分析
　　脂多糖是革蘭陰性菌所

13、特有的細(xì)胞壁成份，具有廣泛的生物學(xué)功能。在前期試驗(yàn)篩選獲得的20個(gè)與溶菌酶抗性相關(guān)的基因中，6個(gè)基因位于galF至gnd基因簇。在大腸桿菌中，該基因簇常常與脂多糖O抗原的生物合成有關(guān)。為了研究這些基因在病原菌抗溶菌酶過程中的作用，提取了野生株NMEC38、缺失株和互補(bǔ)株的脂多糖。SDS-PAGE結(jié)果顯示，野生株NMEC38的LPS圖譜呈現(xiàn)多條條帶，以梯級(jí)狀排列;而缺失株LPS圖譜中僅在靠近膠底處出現(xiàn)1～3條條帶，說明缺失株的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)

14、生了改變。Western blotting結(jié)果證實(shí)缺失株LPS缺失了O特異性側(cè)鏈多糖部分。溶菌酶抑制試驗(yàn)和凝膠過濾層析試驗(yàn)證實(shí)NMEC38 LPS能夠結(jié)合溶菌酶，抑制溶菌酶活性，協(xié)助病原菌抵抗溶菌酶的殺傷作用。利用酸水解法，進(jìn)一步將野生株LPS裂解為O特異性側(cè)鏈多糖和脂質(zhì)A兩部分。結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)不論是側(cè)鏈多糖還是脂質(zhì)A均能與溶菌酶結(jié)合。但是，溶菌酶水解酶活性抑制試驗(yàn)顯示只有O特異性側(cè)鏈多糖能夠抑制溶菌酶水解酶活性，提示脂多糖對(duì)溶菌酶的抑制