尿道致病性大腸桿菌進(jìn)化機(jī)制的研究及檢測(cè)方法的確立.pdf

1、大腸桿菌是一種無(wú)性繁殖的物種,它們有的時(shí)候會(huì)長(zhǎng)期寄居在一個(gè)宿主中,這就為特定時(shí)期內(nèi)研究進(jìn)化提供了機(jī)會(huì)。在這本研究中,我們對(duì)14株來(lái)源于同一個(gè)克隆的尿道致病的大腸桿菌進(jìn)行了測(cè)序。這14株大腸桿菌是在3年的時(shí)間中從一個(gè)有6名成員(包括寵物狗)的家庭中分離得到的,這株菌在第2年后引起了寵物狗的尿道感染。經(jīng)過(guò)基因組分析,我們把這14株菌發(fā)生的所有單核苷酸突變建成一個(gè)樹,通過(guò)估算得到突變的頻率大約為每個(gè)基因組每年發(fā)生1.1個(gè)SNP或者是每年發(fā)生0

2、.17個(gè)sSNP,包括在尿道感染時(shí)期的分析,沒(méi)有證據(jù)表明這些SNP中有適應(yīng)性的突變。盡管如此,這種突變速率比通常假設(shè)的發(fā)生在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中的突變速率低,也有可能在環(huán)境變化的某些情況中這種突變速率會(huì)比較高。宿主的數(shù)據(jù)表明在3年中至少發(fā)生了6次宿主轉(zhuǎn)移的事件?？傊?我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)一株長(zhǎng)宿主大腸桿菌幾年間持續(xù)取樣來(lái)研究大腸桿菌的突變速率是可行的。如果研究足夠多的克隆,這種方法在研究一個(gè)種屬的變異方面是具有非常卓著的優(yōu)點(diǎn)。我們做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的

3、數(shù)據(jù)當(dāng)初并不是為了研究突變速率而得到的,如果更長(zhǎng)時(shí)間范圍的,更頻繁地取樣來(lái)進(jìn)行有目的的研究,我們將會(huì)得到種群動(dòng)態(tài)和變異速率的結(jié)果。本研究首次揭示了致病大腸桿菌的突變和在宿主之間傳播的模式。
　　 尿道感染是最常發(fā)生的細(xì)菌感染,主要是由尿道致病大腸桿菌引起的。引起尿道致病大腸桿菌主要屬于14個(gè)血清型,包括O1,O2,O4,O6,O7,O8,O15,O16,O18,O21,O22,O25,O75和O83,這14個(gè)血清型在臨床樣品中檢

4、出的頻率最高。本實(shí)驗(yàn)中,鑒定了大腸桿菌O1,O2,O18和O75的O-抗原基因簇。確立了一種基于O-抗原特異基因的,可以同時(shí)檢測(cè)14種血清型大腸桿菌多重PCR方法。我們用186種大腸桿菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,47株臨床菌株和其他種屬的10株菌證明了這種方法是有很高的特異性和可重復(fù)性的。靈敏性試驗(yàn)表明,其可檢測(cè)的最小基因組DNA濃度為25ng/μl,用尿液模擬樣品檢測(cè),能檢測(cè)到的最小菌濃為40CFU/ml。我們用此方法檢測(cè)了從醫(yī)院獲得的5分

5、臨床樣品,并用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法對(duì)其中一份樣品的結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)。因此,這種多重PCR檢測(cè)方法可以用于相關(guān)大腸桿菌臨床或者環(huán)境樣品的檢測(cè),并且這種方法在尿道感染病人尿樣的流行病學(xué)調(diào)查中具有非常重要的作用。大腸桿菌作為重要的模式生物,一直是研究致病微生物分子進(jìn)化機(jī)制最好的材料。O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的組成部分,形成了細(xì)菌表面抗原的多樣性。O-抗原分型是鑒定大腸桿菌最普遍的方法。本研究中,共破譯了3株大腸桿菌基因簇,并結(jié)合他們的結(jié)構(gòu)作了遺

6、傳分析,會(huì)使我們對(duì)O-抗原多樣性的本質(zhì)和形成機(jī)制有一個(gè)更為清晰的認(rèn)識(shí),
　　 本研究破譯了大腸桿菌O99的O-抗原結(jié)構(gòu),由主鏈上的4個(gè)鼠李糖殘基和側(cè)鏈上的2個(gè)葡萄糖殘基組成。O99的O-抗原基因簇位于galF基因和gnd基因之間,我們推測(cè)有4個(gè)基因與鼠李糖的合成有關(guān),發(fā)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶基因以及ATP結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)基因(wzm和wzt基因)。我們的研究表明大腸桿菌O99的O-抗原合成依賴于ABC transporter的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。研究中

7、我們發(fā)現(xiàn)沙門氏菌O17的O-抗原主鏈與大腸桿菌O85相同,只在β-Galf殘基處多了一個(gè)O乙?；鶊F(tuán)。通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O85的O-抗原基因簇與之前已經(jīng)報(bào)道的沙門氏菌O17的O-抗原基因簇十分相似。這一對(duì)相似的基因簇在以前并沒(méi)有報(bào)道。通過(guò)比較所有的大腸桿菌和沙門氏菌我們找到了大腸桿菌O85的兩個(gè)特異基因,并用這兩個(gè)基因建立了鑒定大腸桿菌O85的PCR檢測(cè)方法。通過(guò)沙門氏菌066 O-抗原結(jié)構(gòu)的測(cè)定我們發(fā)現(xiàn),沙門氏菌066與大腸桿菌O

8、166的結(jié)構(gòu)非常相似,僅在側(cè)鏈有一個(gè)O乙?；鶊F(tuán)的差別。通過(guò)生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)沙門氏菌O66的O-抗原基因簇與大腸桿菌O166非常相似,它們之間有相似的基因排列方式,唯一不同之處在于沙門氏菌O66的wzy基因被一個(gè)非編碼區(qū)域取代。大腸桿菌O166 wzy的基因功能由構(gòu)建缺失互補(bǔ)菌株實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。我們推測(cè)參與沙門氏菌O66 O-抗原合成的wzy基因位于O-抗原基因簇之外,這種現(xiàn)象以前在沙門氏菌A,B和D1血清群中有過(guò)報(bào)道。沙門氏菌O66和大