NK4基因重組原核表達載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建NK4基因的原核表達載體pET-26b(+)-NK4，轉(zhuǎn)化E．Coli Rosseta(DE3)并表達。優(yōu)化NK4蛋白的表達條件制備重組蛋白并通過體外試驗觀察其活性，為規(guī)?；a(chǎn)NK4蛋白作基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1．NK4基因重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定
　　 以載體pVITRO2-mcs-NK4為模板擴增NK4基因片段，1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離特異性產(chǎn)物，DNA膠回收試劑盒回收、

2、純化NK4基因cDNA并測定濃度。將NK4基因cDNA與載體pMD19-T Simple連接構(gòu)建重組克隆載體pMD19-TSimple-NK4，轉(zhuǎn)化E．Coli DH5a，行氨芐青霉素和α-篩選。采用菌落PCR、Nde I和SalⅠ雙酶切和序列分析等方法，驗證目的基因的存在和序列正確性。
　　 2．重組原核表達載體pET-26b(+)-NK4的構(gòu)建與鑒定
　　 轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4的E．C

3、oli DH5α行增菌，提取重組載體行NdeⅠ和SalⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化，插入經(jīng)相同雙酶切的載體pET-26b(+)。連接產(chǎn)物以冷CaCl2法轉(zhuǎn)化E．Coli Rosseta(DE3)并行卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)篩選，陽性重組菌命名為Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4。重組表達載體用菌落PCR、NdeⅠ和SalⅠ雙酶切等方法驗證目的片段的存在。
　　

4、 3．重組蛋白表達條件的優(yōu)化
　　 1)誘導(dǎo)時間的優(yōu)化：重組菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4接種于LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL卡那霉素、34μg/mL的氯霉素)，37℃過夜，取1 ml菌液以1：50行擴大培養(yǎng)，至OD260為0．6時加入終濃度為0．5 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)表達5 h。每1 h取樣1次，每次80μl，加入20μl5×上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，12000 r/min，3

5、min，行SDS-PAGE分析。
　　 2)IPTG濃度的優(yōu)化：同上增菌后的重組菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4培養(yǎng)物分別加入終濃度為0．1 mmol/L、0．25 mmol/L、0．5 mmol/L、0．75 mmol/L、1．0mmol/L的IPTG，37℃，230 r/min，誘導(dǎo)3 h后取樣同上處理行SDS-PAGE電泳分析。
　　 3)誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化：將同上增菌后的重組菌Rosseta．

6、(DE3)/pET-26b(+)-NK4培養(yǎng)物加入終濃度為0．5 mmol/L的IPTG，分別在16℃、25℃、30℃、37℃，230r/min，誘導(dǎo)3 h后取樣同上處理行SDS-PAGE電泳分析。
　　 4．Western blot分析
　　 重組菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，超聲裂解收集包涵體并洗滌。取洗滌后的包涵體經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加1：500稀釋的兔抗人HG

7、F多克隆抗體，4℃過夜。洗膜后加1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG單抗，室溫振蕩1 h。洗膜后采用DAB試劑盒顯色。
　　 5．重組蛋白的純化
　　 包涵體的洗滌：稱量菌體濕重，以1 g菌：20 mL pH8．0細(xì)菌裂解液混勻后超聲裂解(400 W，10 s，間隔20 s，300次)，4℃、12000 r/min、10 min，棄上清，沉淀按序用pH8．0包涵體洗滌液A，B液和C液，各3次。6 mol/L鹽酸胍溶

8、解包涵體，測定蛋白濃度。
　　 Ni-NTA樹脂親和層析法純化NK4蛋白：以1 mL Ni-NTA樹脂:10 mg蛋白掛柱，5倍NTA體積的無咪唑緩沖液平衡(流速30 mL/h)，再用20 mmol/L～200mmol/L咪唑緩沖液連續(xù)洗脫(流速15 mL/h)。收集吸收峰值的洗脫液，行SDS-PAGE分析，同時以含其他濃度咪唑的吸收峰值洗脫液作為對照。
　　 6．重組蛋白的復(fù)性
　　 將純化的重組蛋白用pH8．

9、0復(fù)性液進行稀釋復(fù)性。復(fù)性后按序用透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行透析，各3次，每6 h換液1次。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍法測定復(fù)性蛋白濃度，真空冷凍干燥后-70℃保存。
　　 7．重組蛋白體外活性測定
　　 重組蛋白作用于Hela細(xì)胞，觀察其對后者的貼壁、遷徙和凋亡等的影響。在Hela細(xì)胞培養(yǎng)物中加入重組蛋白(7μg/mL)，常規(guī)培養(yǎng)，觀察重組蛋白對細(xì)胞貼壁(培養(yǎng)1．5 h)和凋亡(培養(yǎng)24 h)的影響，以

10、加入等量PBS的Hela細(xì)胞組作為對照。無菌蓋玻片平放于6孔板中部，加入Hela．細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，待其貼壁后將蓋玻片取出，培養(yǎng)板底部出現(xiàn)邊界整齊的無細(xì)胞空白區(qū)。加入重組蛋白(7μg/mL)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后觀察重組蛋白對Hela細(xì)胞遷徙的影響，以加入等量PBS的Hela細(xì)胞組作為對照。
　　 結(jié)果:
　　 1．NK4基因克隆載體構(gòu)建與鑒定
　　 NK4基因cDNA與載體pMD19-T Simple連接后成功構(gòu)建

11、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4，轉(zhuǎn)化E．Coli DH5α，篩選出陽性菌落。將菌落直接PCR產(chǎn)物、NdeⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物、重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4提取物同時電泳，可見與目的片段大小相似的特異性條帶(1359 bp)，提示重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4成功構(gòu)建。
　　 取純化的重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4，采用雙脫氧鏈末端終止法行雙向測序，序列測

12、定結(jié)果證實重組于載體NK4基因片段序列正確。
　　 2．重組原核表達載體pET-26b(+)-NK4的構(gòu)建與鑒定
　　 將經(jīng)NdeⅠ和SalⅠ雙酶切后回收的重組克隆載體pMD19-T Simple-NK4和pET-26b(+)的目的片段連接，成功構(gòu)建重組表達載體pET-26b(+)-NK4，轉(zhuǎn)化E．ColiRosseta(DE3)，篩選出陽性菌落。將陽性菌落直接PCR產(chǎn)物、NdeⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物、重組載體pET-2

13、6b(+)-NK4提取物和未酶切重組載體pMD19-T Simple-NK4同時電泳，可見與目的片段大小相似的特異性條帶(1359 bp)，提示重組表達載體pET-26b(+)-NK4獲構(gòu)建成功。
　　 3．重組蛋白表達條件優(yōu)化結(jié)果
　　 誘導(dǎo)條件優(yōu)化實驗表明，當(dāng)重組菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4經(jīng)0．5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h后重組蛋白達最高水平，延長誘導(dǎo)時間未能促進其表達(圖3A)；

14、重組菌經(jīng)各濃度IPTG誘導(dǎo)3 h后發(fā)現(xiàn)組間重組蛋白表達量無明顯差別(圖3B)；重組菌在含0．5 mmol/L IPTG的LB培養(yǎng)基中置4種溫度誘導(dǎo)3 h，發(fā)現(xiàn)37℃組重組蛋白表達量最高(圖3C)。Western blot證實重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的50 kDa的重組蛋白為NK4蛋白(圖3D)，提示重組菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4能表達NK4蛋白。
　　 因此，以37℃，0．5 mol/L IPTG誘導(dǎo)3

15、h作為NK4重組蛋白表達的誘導(dǎo)條件。
　　 4．Western blot分析
　　 洗滌后的包涵體經(jīng)Western blot鑒定后，在分子量大約50 kDa處有特異性的條帶，提示重組蛋白為NK4蛋白。
　　 5．重組蛋白的純化
　　 將溶解的包涵體蛋白掛Ni-NTA柱后用梯度濃度咪唑緩沖液洗脫，取洗脫液測定純度并行SDS-PAGE電泳，采用Bradscan凝膠圖像分析軟件分析洗脫效果。結(jié)果提示60 mmo

16、l/L咪唑緩沖液洗脫的重組蛋白的濃度與純度(95％)均理想，采用其他濃度咪唑緩沖液洗脫效果不佳。
　　 6．重組蛋白的復(fù)性
　　 純化后的蛋白經(jīng)稀釋復(fù)性后，在用透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行透析的過程中有少量蛋白析出，為變性的NK4蛋白，離心后上清行SDS-PAGE電泳可見特異性目的條帶。
　　 7．重組蛋白活性測定
　　 以含7μg/mL復(fù)性重組蛋白的Hela細(xì)胞培養(yǎng)物為觀察組，以加等量PBS的Hela細(xì)胞為對照

17、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)1．5 h后，對照組細(xì)胞已貼壁且形態(tài)呈梭型或不規(guī)則而觀察組細(xì)胞形態(tài)仍為圓形，未發(fā)現(xiàn)貼壁生長：培養(yǎng)24 h后，觀察組細(xì)胞數(shù)量少，可見較多的凋亡細(xì)胞，而對照組細(xì)胞生長理想，凋亡細(xì)胞少見;細(xì)胞遷徙試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h后觀察組細(xì)胞遷徙較對照組明顯受抑制。
　　 上述結(jié)果提示NK4蛋白復(fù)性成功，且保留了生物學(xué)活性。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建了 NK4的原核表達載體pET-26b(+)-NK4。轉(zhuǎn)化重組