康氏木霉cbhI基因的克隆、大腸桿菌表達及真核表達體系的構(gòu)建.pdf

1、纖維素是一類廣泛存在于自然界中的碳水化合物，是一種重要的可再生資源，開發(fā)利用意義重大?？凳夏久梗═richodermakoningii）是自然界存在的分解纖維素的重要微生物之一，它能產(chǎn)生多種纖維素酶，滿足降解纖維素的多種工藝要求。因此，這種絲狀真菌持續(xù)受到研究人員的廣泛關(guān)注。但是，直接用康氏木霉發(fā)酵產(chǎn)酶，不僅菌體生長周期長，產(chǎn)酶量低，工藝成本高，而且，為了研究不同纖維素酶的作用機理，還必須將每一種酶從康氏木霉的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化，因此，

2、限制了康氏木霉的研究和推廣應(yīng)用。
　　 本文克隆康氏木霉的纖維二糖水解酶I基因(cbhI)，并在大腸桿菌宿主中異源表達，為構(gòu)建單一纖維素分解酶的生產(chǎn)體系奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，誘導(dǎo)康氏木霉產(chǎn)生纖維二糖水解酶，然后收集菌體，提取總DNA，以之為模板PCR擴增，測序并檢索GeneBank。再提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。設(shè)計引物，以cDNA為模板PCR擴增目標(biāo)基因，克隆到T載體上進行DNA測序。將測序驗證的片段克隆到表達

3、載體pET-30a(+)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30-cbhl，酶切和PCR驗證后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS。重組子在30℃，180r/min條件下，培養(yǎng)至OD600=0.6，加入終濃度為0.4mmol/LIPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時。離心收集菌體，SDS-PAGE分析表明，特異性表達蛋白帶分子量約67KDa，與預(yù)測目的蛋白大小一致。誘導(dǎo)表達后的菌體經(jīng)超聲波處理，對CMC-Na的酶活力為1.54U/mL。