綠色木霉葡聚糖內(nèi)切酶Ⅰ基因在大腸桿菌中的表達(dá)與分子改造.pdf

1、纖維素可以在纖維素酶系的作用下降解成葡萄糖，而葡萄糖又能用于生產(chǎn)一種新型清潔能源：燃料乙醇。在這個(gè)轉(zhuǎn)化途徑中，纖維素酶降解纖維素成葡萄糖是最大的瓶頸，因此構(gòu)建高效表達(dá)纖維素酶的基因工程菌并獲得高酶活的纖維素酶，對(duì)今后纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的意義。本研究使綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ順利地在大腸桿菌中獲得表達(dá)，對(duì)該酶進(jìn)行純化并測定其酶學(xué)性質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)出韻重組酶在以羧甲基纖維素納(CMC-Na)作為底物時(shí)，其比活為3.8U/

2、mg、Km為18.62mg/mL、Vmax為32.53μmol/min、其催化效率Kcat/Km為1.03 ml/mg.s、其最適反應(yīng)溫度約為48℃、最適反應(yīng)pH值約為5.2、其Tm值在60℃附近。 本研究還通過同源比比對(duì)法，確定了以與綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ氨基酸序列相似性達(dá)到99％的瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)為參考，預(yù)測并選擇了綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ的酶活性中心位點(diǎn)Glu217，Glu222進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其定向突

3、變?yōu)锳sp，而對(duì)活性中心位點(diǎn)Asp219位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，并輔助結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件prosa2003對(duì)其進(jìn)行能量計(jì)算，通過分析計(jì)算結(jié)果，選擇了保守區(qū)的Pro366、Asp242、Pro198三個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變。而后又通過多序列同源比對(duì)法，選擇了非保守區(qū)的Gly291氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)隨機(jī)突變通過篩選，最終只篩選到一株有酶活的突變酶G291S，即Gly突變?yōu)镾er，純化并測定了該突變酶的酶學(xué)性質(zhì)并與野生型酶進(jìn)行了比較，