重組里氏木霉產(chǎn)高活力內(nèi)切-β-葡聚糖酶的研究.pdf

1、纖維素酶是將纖維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱(chēng)，它主要包括外切-β-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等三種組分。在目前最常用的里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶系中，雖然外切-β-葡聚糖酶含量較高，占總分泌酶蛋白的60％左右，但內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力不足，影響了纖維素酶對(duì)纖維素底物的協(xié)同降解效率。采用基因重組技術(shù)，對(duì)里氏木霉進(jìn)行定向進(jìn)化，實(shí)現(xiàn)內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因的高效表達(dá)，對(duì)于提高纖維素酶的生產(chǎn)水平，促

2、進(jìn)其在生物質(zhì)能源和棉織物水洗整理等領(lǐng)域中的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。
　　本文首先研究了內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2在里氏木霉中的同源表達(dá)。通過(guò)RT-PCR法克隆得到里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2，將該基因置于纖維二糖水解酶Ⅰ基因啟動(dòng)子及信號(hào)肽序列(Pcbh1-ss)和纖維二糖水解酶Ⅰ基因終止子序列(Tcbh1)之間，構(gòu)建得到含里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2表達(dá)盒和潮霉素篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pCB-PHT。采用根癌農(nóng)

3、桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將表達(dá)載體pCB-PHT導(dǎo)入里氏木霉分生孢子。研究確定了適宜的轉(zhuǎn)化條件為:分生孢子濃度為107個(gè)/ml、農(nóng)桿菌培養(yǎng)至吸光值0.8(OD660)、液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值5.3、共培養(yǎng)溫度為24℃。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到241株里氏木霉轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步在以CMC為唯一碳源的平板上進(jìn)行初篩，得到6株生長(zhǎng)較快的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)復(fù)篩，獲得了一個(gè)優(yōu)良重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子E5，該菌株在發(fā)酵120h后內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力可高達(dá)3

4、472 U/ml，是出發(fā)菌株ZU-02同期酶活的3.8倍。同時(shí)，重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子的纖維素酶總活力（濾紙酶活力）也提高了32％。該項(xiàng)研究成果在植物纖維原料的生物煉制及生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中將可發(fā)揮重要作用。
　　進(jìn)一步研究了特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因cel5A在里氏木霉中的異源表達(dá)。采用RT-PCR法，從特異腐質(zhì)霉中克隆得到內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因cel5A，其長(zhǎng)度為1116bp，編碼372個(gè)氨基酸殘基。將該基因置于Pcbh1

5、-ss和Tcbh1之間，進(jìn)一步構(gòu)建得到含特異腐質(zhì)霉cel5A基因表達(dá)盒和潮霉素篩選抗性標(biāo)記的載體pCB-HI。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到323株里氏木霉轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步在以 CMC為唯一碳源的平板上進(jìn)行初篩，得到8個(gè)生長(zhǎng)較快的轉(zhuǎn)化子。對(duì)8株里氏木霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶篩選，獲得了優(yōu)良里氏木霉重組菌株H3。采用SDS-PAGE檢測(cè)重組里氏木霉H3的發(fā)酵液，獲得了來(lái)自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶的蛋白條帶（約52 kDa）。該菌株表達(dá)的內(nèi)切-β

6、-葡聚糖酶在pH6.0時(shí)活性最高，在pH5.0-7.0范圍內(nèi)有明顯的催化活性。
　　對(duì)重組里氏木霉H3的發(fā)酵性能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)碳源對(duì)內(nèi)切-β-葡聚糖酶的形成有重要影響，當(dāng)采用乳糖與微晶纖維素的復(fù)合碳源時(shí)，酶活力和產(chǎn)率都可明顯提高。利用玉米漿粉作為氮源，其適宜濃度為12g/L。培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵酶活力及產(chǎn)率有一定影響，適宜的初始pH值為5.0。重組里氏木霉H3搖瓶條件下發(fā)酵120h，其中性?xún)?nèi)切-β-葡聚糖酶活力為3724 U/

7、mL。在2M3的發(fā)酵罐進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，由于溶氧環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞的改善，發(fā)酵96h中性?xún)?nèi)切-β-葡聚糖酶活力可高達(dá)8012 U/mL。
　　纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)可分為纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)、連接橋和催化結(jié)構(gòu)域三部分。為研究里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2的CBD基因片段對(duì)特異腐質(zhì)霉cel5A的影響，克隆得到里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2的CBD基因序列，將其連接到特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因上，進(jìn)一步構(gòu)建得到含啟動(dòng)子

8、Pcbh1和潮霉素抗性標(biāo)記的載體pCB-CEG。將載體pCB-CEG用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入里氏木霉，通過(guò)轉(zhuǎn)化得到260株轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在以CMC為唯一碳源的平板上初篩，得到7株生長(zhǎng)較快的重組菌株。搖瓶產(chǎn)酶篩選后獲得重組里氏木霉HC4，該菌株在發(fā)酵120 h后內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力為3254 U/ml。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:重組里氏木霉HC4所產(chǎn)內(nèi)切-β-葡聚糖酶的作用pH范圍更寬（在pH5.0-7.5范圍內(nèi)有明顯的催化活性），其最