瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ蛋白質(zhì)工程改造和表達(dá)研究.pdf

1、纖維素酶已經(jīng)被成功應(yīng)用于紡織、造紙、食品、飼料工業(yè)，并且隨著生物能源工業(yè)的出現(xiàn)，其市場潛力越來越大。當(dāng)纖維素酶被用于紡織、造紙等纖維加工工業(yè)中時(shí)，往往需要接觸一些偏堿性的環(huán)境。而大多真菌纖維素酶由于在高pH下活力喪失嚴(yán)重，其應(yīng)用受到諸多限制。許多研究者希望通過蛋白質(zhì)工程的手段改造纖維素酶并獲得其最適pH和酶活力均有所上升的突變體酶。 釀酒酵母由于其轉(zhuǎn)化和表達(dá)的高效性是一種良好的分子改造的宿主。許多來源于真菌的纖維素酶已經(jīng)被表達(dá)于

2、釀酒酵母中，并獲得了具有活性的重組酶蛋白。內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ(EGⅡ)是瑞氏木霉中最主要的內(nèi)切酶之一，刪除EGⅡ的瑞氏木霉其內(nèi)切酶活性喪失了55％以上。在本實(shí)驗(yàn)室前期的工作中，從使用釀酒酵母H158構(gòu)建的瑞氏木霉cDNA文庫中獲得了內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ的基因eg2，并利用的定向進(jìn)化方法篩選到一個(gè)最適pH有所提高的突變體。 通過進(jìn)一步研究釀酒酵母中表達(dá)的重組內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ(rEGⅡ)的酶學(xué)性質(zhì)和使用定向進(jìn)化的手段提高其功能，可以進(jìn)一步闡明酶

3、的結(jié)構(gòu)和其最適pH的關(guān)系。這不僅可使瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶更好的應(yīng)用于偏堿性環(huán)境，也為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了有用的數(shù)據(jù)和信息。 本文的研究成果主要如下： 1.分析了糖基化對rEGII的影響首先建立了表達(dá)于釀酒酵母H158的rEG Ⅱ的分離純化的方法，并進(jìn)行了SDS-PAGE后的活性染色：發(fā)現(xiàn)重組EG Ⅱ具有能吸附于陽離子瓊脂糖凝膠的C1和不能吸附的C2兩部分℃1部分是一個(gè)分子量57 KDa的蛋白，經(jīng)內(nèi)切糖苷酶H

4、(Endo H)酶解去除N糖基化后，其分子量下降為54 KDa，并保持大約88％的酶活力℃2部分是一個(gè)大分子量蛋白的集合體，經(jīng)Endo H酶解后，其分子量同樣下降為54 KDa。重組C1和C2部分對底物的降解能力和來源于瑞氏木霉本身的native-EG Ⅱ相似：C2部分具有對更高pH的適應(yīng)性和更好的耐溫性。 2.分析了rEG II第124位去N-糖基化后對重組酶性質(zhì)的影響使用重疊延伸的方法對rEG II的N-糖基化位點(diǎn)N124進(jìn)

5、行了定點(diǎn)突變，獲得了N124D和N124H的突變體。重組N124D和N124H的突變體酶同樣具有C1和C2兩部分，其C1部分的分子量為54 KDa，和經(jīng)Endo H處理過的野生型的C1部分相同，顯示去除N糖基化為其分子量的降低的原因。使用粗酶液測定了它們的胞外CMCase活性、最適pH和對溫度的適應(yīng)性，未發(fā)現(xiàn)去除N-糖基化的突變蛋白和野生型蛋白在以上酶學(xué)性質(zhì)上有明顯區(qū)別。 3.對rEG II的第342位位點(diǎn)進(jìn)行了飽和突變和突變酶

6、性質(zhì)分析，探討了此位點(diǎn)在影響rEG II酶學(xué)性質(zhì)上的作用實(shí)現(xiàn)了對于來源于瑞氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶II的第342位位點(diǎn)的飽和突變，分析了此位點(diǎn)的突變對酶蛋白最適pH和酶活性的影響。將突變氨基酸分成3類，發(fā)現(xiàn)帶有脂肪側(cè)鏈的氨基酸的突變，如突變體N342V，N342I，N342L均可以使酶蛋白的最適pH向中性發(fā)生偏移。最大的偏移發(fā)生在N342R的突變體上，帶來了最適pH大約1.2的偏移，但其酶活力較野生型有大幅度下降。同屬于堿性氨基酸突變的N3

7、42K并未帶來最適pH的改變。同源建模顯示，N342位于EG II外層α螺旋的C端。推測側(cè)鏈的增大和H鍵的增多使螺旋更加的穩(wěn)定，從而影響了酶在高pH下的活力。 4.使用易錯(cuò)PCR和DNA重排的方法實(shí)現(xiàn)了對rEG II的定向進(jìn)化，獲得了幾個(gè)酶學(xué)性質(zhì)有一定改良的突變體使用定向進(jìn)化(包括隨機(jī)突變和DNA重排)的手段實(shí)現(xiàn)了對rEG II的改造。純化的突變體酶中，N39R/L218HAV276R/N342T的最適pH可以達(dá)到6.0～6.2

8、，在pH 6.2時(shí)催化效率較野生型提高了1.4倍。L218H和Q139R/N342T盡管其最適pH變化不大，但其在pH 7.0時(shí)的催化效率較野生型提高了4倍。突變體結(jié)構(gòu)和功能的分析表明，更多穩(wěn)定的螺旋和催化殘基以及底物之間靜電作用的改變是突變體酶性質(zhì)較野生型酶發(fā)生改變的原因。 5.對糖苷水解酶家族5中纖維素內(nèi)切酶信息學(xué)研究對糖苷水解酶家族5中纖維素內(nèi)切酶的氨基酸序列以及最適pH的數(shù)據(jù)進(jìn)行了收集，初步探究了氨基酸組成對纖維素內(nèi)切酶

9、最適pH的影響。研究了纖維素內(nèi)切酶中H+R、C+Y含量與最適pH的關(guān)系：發(fā)現(xiàn)隨著H+R含量的上升，纖維素內(nèi)切酶的最適pH有所上升；隨著C+Y含量的上升，纖維素內(nèi)切酶的最適pH有所下降。收集到7個(gè)已知最適pH和已知晶體結(jié)構(gòu)的纖維素內(nèi)切酶，并和瑞氏木霉EG II的性質(zhì)進(jìn)行了比對，它們的三級結(jié)構(gòu)非常相似，酶解機(jī)制相同但具有完全不同的最適pH。 6.建立了高效的黑曲霉原生質(zhì)體制備和再生的方法為進(jìn)一步提高重組酶蛋白的表達(dá)量，探索了建立黑曲

10、霉轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)的方法。結(jié)果表明，培養(yǎng)14 h的幼嫩菌絲體最適于制備原生質(zhì)體，選用0.6 M KCl為最適滲透壓穩(wěn)定劑，3g/L蝸牛酶-4.5g/L纖維素酶-1.5g/L溶壁酶為裂解酶組合，32 ℃，酶解2 h，原生質(zhì)體的形成量可達(dá)到106～107。采用雙層平板法培養(yǎng)，原生質(zhì)體再生率可達(dá)45％。使用改良轉(zhuǎn)化液，自主復(fù)制型質(zhì)粒ANEp7轉(zhuǎn)化黑曲霉N593的轉(zhuǎn)化率為大約30個(gè)/μg質(zhì)粒。 7.瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ在黑曲霉中的表達(dá)構(gòu)建