《酶工程與蛋白質工程》第章

1、Chapter 7 The application of enzyme,酶的應用,制作：鄭穗平,“綠色健康，“酶”力無限醫(yī)藥、洗滌劑、紡織、淀粉制糖、發(fā)酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒釀造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、飼料、皮革、造紙和化工等工業(yè)領域,酶參與了生物體內所有的生命活動和生命過程,執(zhí)行具體的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血酶等清除有害物質,起保衛(wèi)作用-過氧化物酶，朝氧化物岐化酶等協(xié)同激素等生理活

2、性物質在體內發(fā)揮信號轉換,傳遞與放大作用,調節(jié)生理功能-蛋白激酶催化代謝反應,建立各種各樣代謝體系與代謝途徑-葡萄糖、氨基酸、核酸代謝,酶是生物學有力的研究工具,基因工程工具酶基因組學蛋白組學,酶和工農業(yè)生產與醫(yī)學實踐有著密切的關系,工業(yè)用酶：淀粉糖業(yè)農業(yè)用酶：飼料醫(yī)療用酶：蛋白酶 檢測試劑抗病毒等新藥物開發(fā),Contents of chapter 7,1、酶在醫(yī)藥方面的應用,2、酶在食品方面的應用,3、酶在輕工、化工方

3、面的應用,4、酶在環(huán)境保護中的應用,Go,Go,Go,Go,5、酶在生物技術方面的應用,Go,7.1 酶在醫(yī)藥方面的應用,用酶進行疾病的診斷用酶進行疾病的治療用酶制造各種藥物,1、通過酶活力變化進行疾病診斷,2、用酶測定物質的量的變化進行疾病診斷,,PKU苯丙酮尿癥腦發(fā)育受阻，嚴重腦力呆滯，智商 0－50,苯丙氨酸代謝途徑關系到三種遺傳病,體檢表中有關酶的選項,3、酶在疾病治療方面的應用,溶菌酶,栓溶酶類與心血管疾病,凝血酶,健美

4、生消化酶—幫助腸胃蠕動【產品規(guī)格】90片／瓶【食用方法】成人每日3片，隨主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白質：木瓜蛋白酶50毫克、菠蘿蛋白酶30毫克；2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；5)消化纖維：纖維素酶15毫克。另含：能抑制過多胃酸的葡萄糖酸鈣，能緩解反胃薄荷葉和茴香【適用人群】·消化不良者·腸胃疾病患者·大病

5、初愈者,消化酶類,SOD,,美國醫(yī)學家W·F·安德森等人對腺苷脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個基因治療成功的范例。,1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進行基因治療。這個4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產ADA，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球經過改造，有缺陷的基因已經被健康的基因所替代。經治療

6、后，免疫功能日趨健全。,謝德爾，1999,4、酶在藥物制造方面的應用,青霉素酰化酶與抗生素改造,Iressa 艾若薩 (ZD1839),阿斯利康公司苯胺喹啉化合物（anilinoquinazoline）強效EGFR（表皮生長因子受體）酪氨酸激酶抑制劑。阻斷癌細胞增殖、生長、存活的信號轉導通路。作用機制如下圖：,,增生,X,¯凋亡,血管生成,轉移,細胞膜,癌細胞,ZD1839,EGF,TGFa,,,,X,X,X,細胞核,

7、,,,激酶,X,ZD1839: 作用機制,回本章目錄,淀粉酶類與淀粉糖業(yè),2、酶在食品方面的應用,,果汁生產與果膠酶,乳制品與凝乳酶,果菜清洗,揀果機,3 酶在輕工、化工方面的應用,用酶進行原料處理用酶生產各種輕工、化工產品用酶增強產品的使用效果。,生物拋光是一種用纖維素酶改善纖維素纖維制品表面的整理工藝,以達到持久的抗起毛起球并增加織物的光潔度和柔軟度,Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶,,,儲罐,,反應產物,消

8、旋反應器,固定化酶柱子,,,,,,,,,,,晶體 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,,A-L-Ala A-D-Ala,酶制劑在國外飼料工業(yè)中得到不斷應用，不僅提高了飼料原料的轉化率，也促進了對飼料的消化。,植酸酶Bio-Feed® Phytase ( Ronozyme® P ) 主要用于提高植酸磷的消化率，并相應改善鈣和其它礦物元素的利用率。大大降低了動物糞便中磷的排放量，有益環(huán)保。,酶水解了毛根部的

9、毛囊蛋白而使毛松動脫落。蛋白酶分解皮纖維間質中的可溶性蛋白質，使皮纖維進一步松散軟化。,加速蛋白質的分解,染色溫度降低,皮革脫毛與軟化,加酶洗滌劑,生絲脫膠與羊毛染,蛋白酶,4 酶在環(huán)境保護中的應用,環(huán)境監(jiān)測廢水處理過氧化物酶多酚氧化酶可降解材料開發(fā),5 酶在生物技術方面的應用,生物技術及生物工程是當代世界新技術革命的主要內容之一。在國民經濟的發(fā)展中起著重要作用。生物工程主要包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和蛋白質工程

10、。生物工程以生物體及其代謝產物為主要研究對象。酶是生物催化劑，在生物體及其代謝過程中是必不可少的。,本節(jié)內容,除去細胞壁大分子切割大分子連接劉小燭科研相關實例,除去細胞壁,微生物和植物細胞有細胞壁。生物技術常需除去細胞壁。(1)胞內物質的提取需將細胞壁破壞或除去。(2)原生質體的制備。原生質體與細胞相比有利于物質進出胞內外，在生物工程中很有應用價值。原生質體融合使兩種不同特性細胞原生質體交融結合獲得具有新遺傳特性的細胞

11、。固定化原生質體發(fā)酵使胞內產物分泌到胞外，利于氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞吸收。 在基因工程中，將受體細胞制成原生質體可提高體外重組DNA進入細胞的效率。,除去細胞壁的方法,不同細胞的結構和細胞壁組分不同，采用不同的酶破壞：1·除去細菌細胞壁對于革蘭氏陽性菌采用溶菌酶可專一作用于細胞壁肽多糖分子。對于革蘭氏陰性菌需由溶菌酶和EDTA共同作用才能達到較好的除去細胞壁的效果。EDTA可作用于脂多糖。,2·除去酵母細胞壁

12、,酵母細胞壁有兩層，外層由磷酸甘露糖和蛋白質組成，內層由β－1，3－葡聚糖構成骨架。采用β－1，3－葡聚糖酶使β－1，3－葡聚糖水解。β－1，3－葡聚糖酶與磷酸甘露糖酶及蛋白酶聯(lián)合作用，使細胞壁的內外兩層同時被破壞，顯著提高破壁效果。,3，除去霉菌細胞壁,不同種屬的霉菌，其細胞壁結構和組分差別較大：藻菌綱霉菌的細胞壁主要由幾丁質 和殼多糖等組成。用產生于放線菌或細菌的細胞壁溶解酶（含殼多糖酶、幾丁質酶及蛋白酶等多種酶）。半知菌綱霉

13、菌的細胞壁主要組分是幾丁質和β－葡聚糖等。用β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶的混合物。,4· 植物細胞壁的破除,植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素和果膠等組成。破除植物細胞壁主要采用曲霉菌發(fā)酵產生的纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成的混合酶。,現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國,1926－）1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產生了一種新的重

14、組DNA分子，首次實現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標志著基因工程技術的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學獎。,限制性內切酶,“分子手術刀 ”,限制性酶活性緩沖液甲基化底物性狀,一些限制性核酸內切酶的來源與作用位點,,二、在大分子切割方面的應用,基因工程借助具有專一性的各種水解酶或其他酶類對DNA進行定點切割。發(fā)酵工程使用α-淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等多糖水解酶獲得葡萄糖。酶工程采用蛋白酶

15、對肽鏈有限水解修飾，使酶原活化，生產水解蛋白和氨基酸。RNA酶水解RNA，生產各種核苷酸等。,基因工程常用的水解酶：,1·限制性核酸內切酶是一類在特定的位點上，催化雙鏈DNA水解的磷酸二酯酶。1968年在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在已有300多種。限制性核酸內切酶具有高度的專一性。它能夠識別雙鏈DNA中的某段堿基的排列順序，并在特定位點上將DNA分子切開。,切割方案,識別順序一般由4~6個核苷酸組成，呈二元對稱結構。切割位點

16、一般在識別順序內（有例外）。在切割后，兩條鏈上的切點錯開稱為粘性末端；平整的叫做平整末端。,異源同功酶,異源同功酶：來源不同而識別順序相同。切點可以相同也可以不同。相同：HhaI酶和CtoI酶。 5'·…·GCGC…3' 3'·…·CGCG…5‘

17、 ↑SmaI酶和XmaI酶，識別順序相同，但切點卻不同。 ↓ 5'…CCCGGG…3' 3'…GGGCCC…5' (Sma I) ↓ 5'…CCCGGG…3'

18、 3'…GGGCCC…5' (Xma I),限制性核酸內切酶命名法,獲得該酶的微生物的屬名的第1個字母和種名的頭2個字母共3個字母構成該酶的名稱。若同一種微生物有不同的菌株，將株名加在3個字母之后，同一菌株發(fā)現(xiàn)有幾種酶時，用羅馬字母來區(qū)別。來自淀粉液化桿菌 (Bocillus amyloliquefaciens)的稱為Bam酶。從大腸桿菌Rye13菌株(Echerichia co

19、li Rye13)得到的兩種酶分別命名為EcoRI和EcoRII酶。,2·DNA外切核酸酶,一類從DNA分子末端開始逐個除去末端核苷酸的酶。有些從DNA鏈的5’－末端開始作用有些從3’-末端開始作用有些則可同時作用于5’－末端和3’-末端。,例,基因載體或基因片段太大時，可利用DNA外切酶從兩條鏈的末端各除去一些核苷酸，而使DNA片段變小。為使DNA片段平整末端變成粘性末端，可以采用從5’－末端或3’-末端作用的DNA

20、外切酶，以獲得所需的帶有粘性末端的DNA片段，利于體外重組DNA。該酶還可從DNA生產脫氧核苷酸。,3·堿性磷酸酶,堿性磷酸酶可以除去DNA或RNA鏈中的5’-磷酸。在基因工程中主要用在為防止質粒DNA的自我環(huán)化而除去5’-磷酸。,4·核酸酶S1,作用于單鏈DNA或RNA。在基因工程中，用于從具有單鏈末端的DNA分子申除去單鏈部分的核苷酸，而變成平整末端的雙鏈DNA。RT-PCR往往會生成“發(fā)夾狀”環(huán)，用核酸酶S1

21、就可使這些 "發(fā)夾狀環(huán)"除去。,酶在分子拼接方面的應用,生物體內有許多酶具有分子拼接能力－－將兩個或多個分子連接在一起合成大分子。目前將這些酶提取分離出來應用的還不多。在生物工程方面，有成功應用的例子。,1. DNA連接酶,發(fā)現(xiàn)于1967年、能使雙鏈DNA的缺口封閑。它催化DNA片段的5’-磷酸基與另一DNA片段的3’-OH生成磷酸二酯鍵?；蚬こ坛２捎肨4-DNA連接酶（由T4-噬菌體感染大腸桿菌細胞后產生

22、），將由同一種限制性核酸內切酶切出的載體DNA和目的基因連接起來，成為重組DNA（粘性和平末端）。,2·DNA聚合酶,一類催化DNA復制和修復損傷的酶。主要包括大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III和T4-DNA聚合酶等。這類酶的作用方式是催化一個脫氧核苷三磷酸加到模板引物的3’-OH上，并放出一個焦磷酸分子。(dNMP)n+dNTP ? (dNMP) n＋1+PPi加進的脫氧核苷三磷酸符合下列條件：3’…CTGGATG

23、CC 3’…CTGGATGCC 5’…GACC－OH + dTTP→ 5’…GACCT－OH ＋PPi (引物),DNA聚合酶的共同特點是,(1)需要模板和引物。(2)不能起始新的DNA鏈的合成。(3)催化脫氧核苷5’-三磷酸加到DNA鏈的3'-OH末端。(4)合成的方向是從5'-末端至3‘-末端。在基因工程中，主要應用DNA聚合酶進行缺口

24、修補。,3·末端脫氧核苷酸轉移酶,末端脫氧核苷酸轉移酶 (Terminal DeoxynucleotideTransferase，TDT)從小牛胸腺分離得到。其作用是向DNA的3’-OH末端轉移脫氧核苷酸。在基因工程利用該酶給DNA片段加上一段同聚體，形成附加末端?；蛘哂?2P標記的脫氧核苷酸進行3'-末端標記。,劉小燭科研相關應用,反轉錄酶：該酶又稱反轉錄酶和依賴于RNA的DNA聚合酶。它以RNA為模板合成DN

25、A。該酶在基因工程中用于從mRNA反轉錄生成互補DNA(cDNA)。,Mabinlin,金屬蛋白酶催化N-末端經修飾保護的L-天門冬氨酸與L-苯丙氨酸縮合生成甜味劑阿斯巴甜 (Aspar-tame)。,可被生物降解塑料,H O │ ‖－【－O－C－（CH2）x－C－】n －

26、 │ R可被生物降解塑料鏈烷酸聚合物的通式。,PHB(poly-3-hydroxybutyrate, 聚3-羥基丁酸酯)，用攜帶有植物啟動子的載體將下列基因構建為一個操縱子：啟動子－phbC－phbA －phbB ↓ ↓ ↓ PHB合酶 β-酮硫裂解酶 乙酰乙酰CoA還有酶β-酮硫裂解酶：乙酰Co