里氏木霉木聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中高效表達(dá)的研究.pdf

1、木聚糖是半纖維素中含量最豐富的一種組分，在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素，約占細(xì)胞干重的35％。它的存在使谷物中的營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分暴露于動(dòng)物消化液的表面，進(jìn)而影響動(dòng)物的消化吸收，降低了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。 木聚糖酶(1，4-β-D-xylanxylanohydrlase，EC3.2.1.8)通過內(nèi)切方式水解木聚糖分子中的β-1，4-木糖苷鍵，水解產(chǎn)物以木寡糖和木二糖為主。隨著木聚糖酶在造紙、食品、飼料等領(lǐng)域的成功應(yīng)用，它已成為酶制

2、劑產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要產(chǎn)品，在生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。具有很大的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。但是目前傳統(tǒng)的木聚糖酶生產(chǎn)方法產(chǎn)量較低，限制了其廣泛應(yīng)用，應(yīng)用基因工程技術(shù)可望解決這一問題。 本研究以里氏木霉(Trichodermareesei)QM9414菌株為基因供體,克隆木聚糖酶基因xyn2，分別構(gòu)建其大腸桿菌表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)到大腸桿菌和畢赤酵母中。進(jìn)一步對表達(dá)的木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)分析，

3、為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 以木聚糖為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)里氏木霉表達(dá)木聚糖酶，確定了最佳誘導(dǎo)時(shí)間為72小時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下最大酶活為6.32IU/ml。里氏木霉木聚糖酶最適pH值為4.0，最適溫度為50℃。 采用RT-PCR方法克隆到了里氏木霉木聚糖酶基因xyn2。測序得到xyn2基因的序列與GeneBank上編號為U24191的xyn2基因序列完全相同。采用PCR法，以里氏木霉DNA為模板克隆了里

4、氏木霉木聚糖酶基因。測序得到xyn2基因的DNA序列，與xyn2基因的cDNA序列進(jìn)行了比對，確定了xyn2基因含有一個(gè)內(nèi)含子。 構(gòu)建了xyn2基因的大腸桿菌表達(dá)載體pEK1。將pEK1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下最大酶活為42.28IU/ml。對表達(dá)的木聚糖酶性質(zhì)進(jìn)行了分析，確定最適pH值為6.5，最適溫度為45℃。 構(gòu)建了xyn2基因畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-xyn2。搖瓶