解淀粉芽孢桿菌木聚糖酶A基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其定向進(jìn)化研究.pdf

1、β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶（以下稱(chēng)木聚糖酶）是木聚糖最關(guān)鍵的水解酶之一，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料和造紙等領(lǐng)域。多數(shù)常規(guī)的野生型或重組木聚糖酶的催化活性較低、穩(wěn)定性較差，難以滿(mǎn)足在不同應(yīng)用領(lǐng)域的需要。本研究克隆到解淀粉芽孢桿菌木聚糖酶A基因（baxA），并在Escherichia coli BL21（DE3）和Pichia pastoris GS115中獲得分泌表達(dá)；采用定向進(jìn)化技術(shù)（易錯(cuò)PCR和DNA改組）對(duì)該酶進(jìn)行改造，以期獲得具備較理想

2、酶學(xué)性質(zhì)的突變體；同時(shí)揭示與解淀粉芽孢桿菌木聚糖酶A催化活性、熱穩(wěn)定性相關(guān)的部分關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)或區(qū)域。主要結(jié)果如下：
　　1.克隆得到baxA基因并成功構(gòu)建獲得分泌表達(dá)的大腸桿菌工程菌pCbaxA15。以實(shí)驗(yàn)室前期分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為出發(fā)菌，設(shè)計(jì)特異性引物克隆到baxA基因（GenBank登錄號(hào)：KM624029），該基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）為642bp，編碼213個(gè)氨基

3、酸殘基，含6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，理論分子量為23.3kDa。baxA定向插入到新型表達(dá)載體pCold TF中，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），在15°C下誘導(dǎo)表達(dá)，重組酶（reBaxA）能夠分泌到培養(yǎng)基中；采用高親和Ni-樹(shù)脂層析純化reBaxA，純化后的reBaxA比活為2.63U/mg；純化SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果表明，該重組酶的分子量約為77.3kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，reBaxA的最適溫度和

4、最適pH分別為55°C，pH6.0；Km、Vmax分別為16.05mg/mL、45.66μmol/min/mL。reBaxA分別水解燕麥、山毛櫸、樺木木聚糖，水解產(chǎn)物為木二糖至木五糖（X2-X5），主要產(chǎn)物分別為木四糖（X4）、木三糖（X3）、木五糖（X5）。
　　baxA基因定向插入pET30a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE、Western Blot和活性測(cè)定分析結(jié)果表明，b

5、axA獲得了重組表達(dá)，特異性條帶明顯，但表達(dá)產(chǎn)物無(wú)木聚糖酶活性，推測(cè)重組蛋白主要以包涵體形式存在。
　　2.成功構(gòu)建獲得分泌表達(dá)的畢赤酵母工程菌PPbaxA10。baxA基因定向插入穿梭載體pPICZαA，重組質(zhì)粒pPICZαA-baxA線性化后電擊轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Zeocin抗性、PCR鑒定和活性檢測(cè)，獲得酵母工程菌PPbaxA10，其接種于50mL YPD培養(yǎng)基中，從第24h開(kāi)始添加甲醇誘導(dǎo)

6、，第120h時(shí)，該工程菌發(fā)酵上清木聚糖酶比活為8.18U/mg，Km，Vmax分別為5.41mg/mL，22.42μmol/min/mL。在50°C，pH5.0時(shí)，rePPBaxA10表現(xiàn)出最高的活性。
　　3.采用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建突變文庫(kù)，篩選得到酶活提高的突變體pCbaxA50。在baxA基因PCR擴(kuò)增體系中，提高M(jìn)g2+和dTTP，dCTP的濃度，并額外添加Mn2+，該引物中限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)均引入3個(gè)保護(hù)性堿基，故

7、PCR產(chǎn)物的膠回收產(chǎn)物直接用于雙酶切，并定向插入表達(dá)載體pCold TF中，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)，共獲得1463個(gè)單菌落，采用96孔板法快速篩選突變文庫(kù)，其中pCbaxA50分泌的胞外重組酶活性較高，測(cè)序結(jié)果表明，存在一個(gè)氨基酸殘基突變，S138T；重組酶reBaxA50的比活為9.38U/mg，其最適溫度和最適pH分別為50°C，pH5.0。突變酶在60°C時(shí)的半衰期為9.74min，TGA-DSC分析結(jié)

8、果表明突變酶和其親本的Tm值分別為89.15°C和88.95°C。
　　4.結(jié)合褐色高溫單孢菌木聚糖酶基因，采用DNA改組技術(shù)對(duì)解淀粉芽孢桿菌木聚糖酶A進(jìn)行改良。根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，克隆得到褐色高溫單孢菌木聚糖酶基因的催化域序列（tfxCD）與baxA基因的成熟肽編碼序列（mbaxA），二者混勻后經(jīng)DNaseⅠ隨機(jī)片段化，割膠回收分子量小于100bp的DNA片段并進(jìn)行無(wú)引物PCR，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行有引物PCR，所得產(chǎn)物雙酶

9、切后定向插入表達(dá)載體pCold TF，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），構(gòu)建突變文庫(kù)，共得到2250個(gè)單菌落。采用96孔板高通量篩選得到酶活提高的突變體pCbaxA153，pCbaxA241，pCbaxA428，還選取了酶活下降的突變體pCbaxA199。4個(gè)突變酶，reBaxA153，reBaxA199，reBaxA241，reBaxA428中分別產(chǎn)生了N29S，T33I，S31R，I51V的氨基酸突變，比活分別為11.95，2.