β-1,3-葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達.pdf

1、國內(nèi)圖書分類號：Q933學校代碼：10213國際圖書分類號：579密級：公開理學碩士學位論文理學碩士學位論文β13葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達碩士研究生：程政翔導師：宋金柱教授申請學位：理學碩士學科、專業(yè)：生物學所在單位：生命科學與技術學院答辯日期：2013年6月授予學位單位：哈爾濱工業(yè)大學哈爾濱工業(yè)大學理學碩士學位論文摘要球毛殼菌（Chaetomiumglobosum）是微生物農(nóng)藥家族中重要的一員，對許多植物病害具有預防治療的作用。其中

2、，球毛殼菌所分泌的β13葡聚糖酶可以水解纖維素中的糖苷鍵，對植物病原菌有強烈的抑制作用。因此，由球毛殼菌中獲取β13葡聚糖酶的基因并使之高度表達，深入研究β13葡聚糖酶與病原菌的相互作用，對生物農(nóng)藥的推廣有著重要意義。本實驗所獲得的β13葡聚糖酶的基因全長為1683bp，cDNA長度為1605bp。首先，利用含有EcI和NotI酶切位點的引物，擴增出目的基因cgglu。隨后，將目的基因cgglu以及表達載體pPIC9K利用EcI以及No

3、tI進行雙酶切，再利用T4DNALigase把目的基因cgglu與表達載體pPIC9K連接，從而構建出重組表達載體pPIC9Kcgglu。將pPIC9Kcgglu經(jīng)過Kpn2I線性化后，通過電轉化的方法轉化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中。梯度電壓實驗顯示，電壓為1000V時轉化效率最高，每微克轉化子可達80個以上。從轉化子平板中隨機挑選48個轉化子，通過MD及MM平板篩選法進行Mut以及MutS型轉化子的分辨。挑選8個Mut轉化子進行

4、PCR檢測，證實重組表達載體成功轉化進入畢赤酵母GS115中。隨機挑選5個轉化子進行誘導表達，并且利用SDSPAGE進行檢測。其中4個轉化子成功分泌目的重組蛋白CGGLU，條帶大小在50kDa與85kDa之間，比理論值大小54kDa略大。酶學性質(zhì)分析結果顯示，重組蛋白CGGLU最適催化溫度為45℃，誘導96h所產(chǎn)生的重組蛋白CGGLU酶活最高，絕對酶活值可達0.186U。抑菌試驗顯示，重組蛋白CGGLU對三種不同植物病原菌：立枯絲核菌（