灰蓋鬼傘β-1,3-葡聚糖酶的異源重組表達研究.pdf

1、真菌細胞壁是位于真菌原生質(zhì)體外的一種剛性結(jié)構(gòu)，對真菌細胞進行正常的生理活動起到重要的保護作用。在真菌細胞生長發(fā)育及繁殖的過程中，細胞壁的結(jié)構(gòu)和組分會發(fā)生一定的變化，主要表現(xiàn)為細胞壁逐漸地擴張。對釀酒酵母和曲霉的研究成果認為細胞壁擴張的過程是在一系列酶的參與下完成的，β-1，3-葡聚糖酶是其中較為重要的酶類，它通過水解作用使細胞壁松弛，再以轉(zhuǎn)糖基作用將新合成的葡聚糖鏈加入到原有的細胞壁結(jié)構(gòu)中，使細胞壁得以擴張。為探究在擔子菌類食用菌中β-

2、1，3-葡聚糖酶對細胞壁變化所發(fā)揮的作用，我們以大型傘狀真菌灰蓋鬼傘為研究材料，初步分析了其基因組中的β-1，3-葡聚糖酶基因，并篩選了其中較為重要的基因進行重組表達研究，最終獲得了2個具有相應(yīng)活性β-1，3-葡聚糖酶，并對它們的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。以原核表達系統(tǒng)大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主細胞表達出了外切β-1，3-葡聚糖酶（EXG1）。重組菌在20℃下經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后可大量表達出目的蛋白，經(jīng)

3、過超聲破碎和Ni-柱層析后可純化得到EXG1。EXG1分子量大小為85 kDa，酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果表明該酶最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH環(huán)境為pH6.0，只對β-1，3-葡聚糖底物有外切活性，未檢測到轉(zhuǎn)糖基活性。以昆布多糖為底物時反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km=2.23 mg ml-1，Vmax=232.56μmolmg-1 min-1。以真核表達系統(tǒng)畢赤酵母GS115為宿主細胞表達出了內(nèi)切β-1，3(4)-葡聚糖酶（eng16A）。重組菌在30

4、℃下以濃度為0.5％的甲醇進行誘導(dǎo)，可表達出重組酶并分泌到胞外的培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基用Ni-柱純化后可收獲大量的eng16A蛋白。eng16A分子量大小為60 kDa。對該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH環(huán)境為pH6.0，對含有β-1，3-糖苷鍵的底物均能表現(xiàn)出水解活性，未檢測到轉(zhuǎn)糖基活性，在以昆布多糖為底物時，反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km=6.49 mg ml-1，Vmax=57.47μmol mg-1 min-1，在

5、以大麥葡聚糖為底物時，反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km=20.84 mg ml1，Vmax=384.62μmol mg-1min-1。
　　本研究分別以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主，對兩種β-1，3-葡聚糖酶基因進行了重組表達，獲得了具有正確酶活性的日的蛋白，并且用Ni-柱進行分離純化得到了大量的純酶。避免了以灰蓋鬼傘子實體為原始材料進行層析色譜法純化過程中子實體生長周期長，純化步驟繁瑣且最終收獲的酶量少等一系列問題。同時，我們對這兩種β-1，3-