里氏木霉RUT-C30甘露聚糖酶基因man1在畢赤酵母中的高效表達.pdf

1、甘露聚糖類物質是自然界中半纖維素的第二大組分，分布廣泛。β-甘露聚糖酶能水解底物生成甘露寡糖，釋放出與之結合的水分、微量元素等。應用于豬、雞、鴨和水產(chǎn)動物日糧，可提高飼料的利用效率，減少養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境污染。甘露寡糖具有改善動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境的功能。多種細菌、真菌、軟體動物等分泌β-甘露聚糖酶，其基因屬于糖基水解酶家族5。β-甘露聚糖酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護等方面有著廣泛的用途。因此本研究的主要目的就是構建甘露聚糖酶的工程酵母來高效表達甘露

2、聚糖酶，以解決目前甘露聚糖酶產(chǎn)量低、成本高等問題，同時也為生產(chǎn)甘露寡糖提供有效的解決途徑。 本文利用畢赤酵母(Pichiapastoris)表達甘露聚糖酶(mannanase)。首先將man1克隆到畢赤酵母穿梭表達載體pPIC9K中，構建重組質粒pPIC9K-man1，經(jīng)SacⅠ線性化酶切，PEG將其整合到畢赤酵母GS115(His-Mut+)染色體上，利用MM、MD平板篩選His+Muts型陽性克隆，在含不同濃度G418-YP

3、D平板篩選高拷貝轉化子。共篩選28株陽性克隆，將篩選到1株高拷貝菌株進行5L發(fā)酵罐優(yōu)化表達研究，經(jīng)測定蛋白分泌量達1.5mg/mL。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組目標蛋白質量分數(shù)達到總蛋白的90％以上；相對分子質量為66KD，較理論設計值大，分析是因目標蛋白發(fā)生糖基化所致。該重組轉化子RMAN23遺傳穩(wěn)定性良好。甘露聚糖酶活性測定結果為250IU/mL(刺槐豆膠為底物)和470IU/mL(魔芋為底物)。通過酶學性質研究該酶反應