棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因tachi1在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、HighLevelExpressionofChitinaseGene(tachil)fromTrichodermaasperelluminPichiapastorisThesissubmittedtoQjngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceTangWei(CollegeofLifeScience)Supe

2、rvisorAssociateProLXianHLgquaneSOF“Associaro!XianHongonanQingdaoChina青島農(nóng)業(yè)大學(xué)摘要棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因tachil在畢赤酵母中的高效表達(dá)摘要幾丁質(zhì)酶作為木霉菌防治植物病蟲(chóng)害的主要因子，在生物防治和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。為了研究棘孢木霉(Trichodermaasperellum)幾丁質(zhì)酶及其酶學(xué)性質(zhì)，明確生防機(jī)制，將棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因tachil(不舍信

3、號(hào)肽)克隆到分泌性表達(dá)載體pPIC9K上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K／tachil，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，篩選獲得了高效分泌表達(dá)幾丁質(zhì)酶Taehil的酵母工程菌GStachilK，對(duì)其進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)Tachil的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，純化目的蛋白并進(jìn)行酶擎生質(zhì)的研究。結(jié)果表明，GStachil—K的最佳表達(dá)條件opH為65，甲醇誘導(dǎo)濃度為O5％，起始細(xì)胞濃度為0／)600=2，甲醇誘導(dǎo)時(shí)間為180h；幾丁質(zhì)

4、酶TachiI活力可達(dá)1793U／mL，蛋白表達(dá)量為619g／L；表達(dá)的幾丁質(zhì)酶表觀分子量約為44kDa，酶反應(yīng)最適的溫度和pH分別為50℃和55，具有較寬的溫度、pH適用范圍；50℃以下保持較高的酶活力，在堿性條件下穩(wěn)定性較差；米氏常數(shù)玉，m和最大反應(yīng)速度p，舭。分別為6537g／L和4737x103lunol／Lmin；TachiI受Ag、H礦、cu2、Fe2和高濃度的SDS及p巰基乙醇強(qiáng)烈抑制幾丁質(zhì)酶基因tachil生物信息學(xué)分析

5、顯示，該基因鳊碼424個(gè)氨基酸；Taehil屬于糖基水解酶18家族內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，包含SIGGW底物結(jié)合位點(diǎn)和FDGIDVDWE活性中心位點(diǎn)，信號(hào)肽長(zhǎng)度為22個(gè)氨基酸；含有1個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)以(it螺旋、D折疊和無(wú)規(guī)則卷曲為結(jié)構(gòu)元件，三級(jí)結(jié)構(gòu)為(彬p)8的圓桶形結(jié)構(gòu)重組幾丁質(zhì)酶可抑制多種病原真菌茵絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)，其中對(duì)板栗疫病病菌、楊樹(shù)腐爛病病菌和蘋(píng)果腐爛病病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)。關(guān)鍵詞：棘孢木霉；凡丁質(zhì)酶；