白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表達及分子改造.pdf

1、纖維素(Cellulose)是地球上最豐富的有機物質(zhì)，它是光合作用最主要的產(chǎn)物，同時也是最豐富的可再生資源，地球上每年光合作用可產(chǎn)生大于100億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素。但纖維素的利用目前尚未完全開發(fā)，隨著地球石化能源短缺和枯竭的日趨嚴峻，人類把眼光轉(zhuǎn)向了對纖維素的利用，利用纖維素酶將纖維素降解為可發(fā)酵的單糖，進而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。然而目前發(fā)現(xiàn)的纖維素酶都存在活力低和反應速度慢的缺點，因此尋找新的或者通過改造現(xiàn)有的纖維

2、素酶基因獲得活力更高纖維素酶是解決纖維素開發(fā)利用的關鍵問題。 本研究提取了臺灣家白蟻總RNA通過RT-PCR擴增出白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因，并分別構建了表達內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的大腸桿菌和釀酒酵母表達載體。利用金屬鎳親和層析對大腸桿菌表達的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶進行純化，CMC酶活檢測顯示純化酶的最適溫度和最適pH值分別為42℃、6.5；內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax為0.071mg/ml*min，Km

3、值為80.2712mg/ml，比活力為130544U/mg。利用定點突變對白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因進行改造，首先是借助計算機根據(jù)白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的同源建模三維結構信息，利用ProSA2003軟件根據(jù)能量(knowledge-based potentials)最低化原則，計算機輔助設計確定白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶氨基酸飽和突變位點，通過同源建模分析表明53D、56D和411E三個位點都是活性中心位點。利用兼并

4、引物對53，56，411位點的氨基酸分別進行飽和突變，篩選到三個有活力的突變子C53、E53和C56。對突變酶進行酶學性質(zhì)的研究表明，C53的最適溫度、最適pH、米氏常數(shù)、Vmax和比活力分別為42℃、6.5、37.683 mg/mL、0.0334umol/mL*min、9.912 U/mg；突變酶E53的最適溫度、最適pH、米氏常數(shù)、Vmax和比活力分別為37℃、6.5、93.819mg/mL、0.124umol/mL*min、16.