大腸桿菌素通道結(jié)構(gòu)域-CSP原核載體的構(gòu)建、表達及抗菌作用的研究.pdf

1、牙菌斑生物膜是黏附于牙面或修復(fù)體表面的微生物團塊，不能被水沖去或漱掉。生物膜的形成可增加細菌抵抗宿主防御的功能、降低抗生素的殺滅作用，并使各種細菌能在合適的微環(huán)境中發(fā)揮不同的致病作用。變異鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌，它以生物膜的方式生長,通過密度感應(yīng)系統(tǒng)（quorumsensing，QS）根據(jù)周圍環(huán)境變化來進行自身調(diào)節(jié)，以便更好地適應(yīng)生存環(huán)境。通過感受刺激多肽（competencestimulatingpeptide，CSP）介導(dǎo)的變異鏈

2、球菌的QS系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)生物膜的形成、糖代謝、耐酸能力以及多種毒力因子的分泌，對變異鏈球菌在復(fù)雜的口腔環(huán)境中生存有重要的意義。大腸桿菌素Ia是大腸桿菌分泌的一類細菌素，可以作用于細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，通過其C端的通道結(jié)構(gòu)域，形成電壓依賴性離子通道，致使靶細菌崩解、死亡。
　　本課題將編碼大腸桿菌素Ia通道結(jié)構(gòu)域的基因（ColicinIachanneldomain）與編碼變異鏈球菌CSP的基因重組，制備出ColicinIachanne

3、ldomain-CSP融合蛋白并純化出抗變異鏈球菌多肽，通過生物學(xué)活性的分析進一步評估此抗菌肽的作用，以期為齲病的防治尋找一條新的途徑。
　　本研究分為三部分：
　　第一部分大腸桿菌素通道結(jié)構(gòu)域（ColicinIachanneldomain）與變異鏈球菌感受刺激多肽（CSP）基因重組和序列測定
　　根據(jù)在GenBank中登錄的ColicinIachanneldomain的完整的DNA序列，設(shè)計一對引物，采用PCR的方法

4、從裝載了大腸桿菌素Ia（ColicinIa）的宿主菌中擴增得到ColicinIachanneldomain全長序列，將其克隆入帶有麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）的pMAL-c2x載體中，并且將合成的變異鏈球菌感受刺激多肽（CSP）的核酸片段，經(jīng)退火后也連入此載體中，經(jīng)測序證實無堿基突變或缺失。
　　第二部分重組質(zhì)粒pMAL-c2x-ColicinIachanneldomain-CSP在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達及分離和純化
　　將含有pM

5、AL-c2x-ColicinIachanneldomain-CSP的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，通過IPTG誘導(dǎo)，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE顯示在約62KD處有預(yù)期的條帶。對不同IPTG濃度和誘導(dǎo)時間的融合蛋白表達率分析結(jié)果表明：不同IPTG濃度對表達量無明顯差異，誘導(dǎo)4小時表達量達高峰。將菌體進行超聲波破碎細胞，離心收集上清液。將上清液經(jīng)直連淀粉親和樹脂純化后，收集洗脫液得到目的蛋白。
　　融合蛋白經(jīng)FactorXa裂解為麥