小鼠甘露糖受體糖識別結(jié)構(gòu)域的載體構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、甘露糖受體(Mannose Receptor，MR)又稱CD206，是MR家族成員之一，屬C-型凝集素受體，最早發(fā)現(xiàn)于大鼠肝枯否細(xì)胞，后發(fā)現(xiàn)廣泛存在于動物體內(nèi)的多種細(xì)胞，主要生物學(xué)功能表現(xiàn)在介導(dǎo)內(nèi)吞清除內(nèi)外源的多糖，多肽，蛋白，核酸和殺滅病原體，轉(zhuǎn)運(yùn)和遞呈抗原啟動免疫應(yīng)答，是保守的模式識別受體(Pattern Recognition Receptor，PRR)之一。 據(jù)報(bào)道，表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的MR是L-選凝蛋白的天然配體，

2、兩者的相互作用介導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的歸巢。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明小鼠肝癌細(xì)胞高低淋巴道轉(zhuǎn)移株HCa-F和HCa-P的淋巴道轉(zhuǎn)移潛能與其表達(dá)的L-選凝蛋白正相關(guān)，此外，發(fā)現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞p388D1的淋巴道轉(zhuǎn)移潛能也與其表達(dá)的L-選凝蛋白相關(guān)。故認(rèn)為MR與L-選凝蛋白存在的相互作用可能介導(dǎo)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移機(jī)制與淋巴細(xì)胞的“歸巢”相似。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?利用DNA重組技術(shù)將甘露糖受體MR的C-型凝集素樣糖識別結(jié)構(gòu)域4-7(CT-LD

3、4-7)與分泌性信號肽Sig和人IgG的Fc段構(gòu)成嵌合基因，插入到真核表達(dá)載體pCDNA3.1中，瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，檢測蛋白表達(dá)，為以后利用Protein-A親和層析純化蛋白，進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證甘露糖受體MR與L-選凝蛋白相互作用，以及究其相互作用與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性提供基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．酶切鑒定本實(shí)驗(yàn)室已有的連接有MR CTLD1-8序列的T載體，記為pMD-18T/CTLD1-8，并以之為模板自行設(shè)計(jì)引物進(jìn)

4、行PCR擴(kuò)增MRCTLD4-7序列(1701 bp)，通過TA亞克隆將CTLD4-7基因插入pMD-18T載體中構(gòu)建載體pMD-18T/CTLD4-7，轉(zhuǎn)化細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒，酶切鑒定并測序。 將pMD-18T/CTLD4-7的CTLD4-7基因酶切并切膠回收，插入表達(dá)載體pX(pX載體的酶切位點(diǎn)上游連有IgG的分泌性信號肽，下游連有人IgG的Fc段)中，擴(kuò)增并酶切鑒定后命名為pX/CTLD4-7。 單酶切pX/CTLD4-7

5、和表達(dá)載體pCDNA3.1，回收pX/CTLD4-7的酶切產(chǎn)物片段Sig-CTLD4-7-Fc(2451bp)和pCDNA3.1片段，連接兩者，構(gòu)建的表達(dá)載體記作pCDNA3.1/Sig-CTLD 4-7-Fc，酶切鑒定，并用PCR的方法確定連入片段的方向，之后進(jìn)行測序鑒定。 2．培養(yǎng)293T細(xì)胞，脂質(zhì)體法將去內(nèi)毒素的pCDNA3.1/Sig-CTLD4-7-Fc表達(dá)載體小量瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，同時(shí)作陰性對照和陽性對照，分別在24