甘露糖陽離子脂質(zhì)體基因載體的合成與性能研究.pdf

1、陽離子脂質(zhì)體具有細(xì)胞毒性低、無免疫原性以及制備方便、使用簡單、易于保存等諸多優(yōu)點(diǎn)，而倍受學(xué)者關(guān)注，是目前最有前景的非病毒性基因載體。
　　本論文合成了兩類陽離子脂質(zhì)體。一類以甘露糖為原料，通過全乙酰化、脫1-O-乙酰基、三氯乙酰亞胺酯化、糖苷化、疊氮化、脫全部乙酰基、4，6-O-芐叉基保護(hù)、醚化、脫芐叉基保護(hù)、還原氨化和季銨鹽化反應(yīng)，合成不同長度的疏水鏈連接在糖環(huán)上的甘露糖陽離子脂質(zhì)一系列:di-C12-Man-TMA、di-C1

2、4-Man-TMA、di-C16-Man-TMA和di-C18-Man-TMA;另一類以甘露糖為原料，通過全乙?；?、脫1-O-乙酰基、三氯乙酰亞胺酯化、糖苷化、疊氮化、脫全部乙?；?、還原氨化、叔胺化、和季銨鹽化反應(yīng)，合成另一系列不同長度的疏水鏈連接在頭基的甘露糖陽離子脂質(zhì):Man-DiC12MA、Man-DiC14MA、Man-DiC16MA和Man-DiC18MA。
　　將脂質(zhì)溶于二次蒸餾水中，超聲至澄清，制備成陽離子脂質(zhì)體，再

3、跟裝載EGFP的質(zhì)粒DNA混合制備得到脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。采用原子力顯微鏡觀察陽離子脂質(zhì)體和陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的形態(tài)。用Zetasizer Nano ZS激光粒度儀測定陽離子脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物的Zeta電勢、平均粒徑和粒徑分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:脂質(zhì)體di-C18-Man-TMA和Man-DiC18MA的平均粒徑分別為624.1nm和502.2nm，因?yàn)槠骄狡蠖贿m于基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。其它6種單一脂質(zhì)體的平均粒徑在40-200nm之

4、間，與之對應(yīng)的DNA復(fù)合物的平均粒徑在60-200nm之間。di-C18-Man-TMA的Zeta電位為26mV，其它7種脂質(zhì)體的Zeta電位都大于35mV。通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，探測陽離子脂質(zhì)體跟質(zhì)粒DNA的結(jié)合能力以及完全復(fù)合時(shí)的N/P比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在N/P比為3∶1時(shí)，各陽離子脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA結(jié)合完全，而且，隨著脂質(zhì)體的增加，DNA延滯作用越明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各陽離子脂質(zhì)體適于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA。
　　選擇商用轉(zhuǎn)染試劑L

5、ipo2000作為對照組，觀察攜帶pEGFP的兩類脂質(zhì)體在HEK293細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況，并評估離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，疏水鏈與糖環(huán)鏈接的陽離子脂質(zhì)體基本沒有轉(zhuǎn)染效率，而疏水鏈與季銨鹽頭部相連的陽離子脂質(zhì)體系具有較高的轉(zhuǎn)染效果，其中Man-DiC16MA具有較好的轉(zhuǎn)染效果。
　　商用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000作為對照組，Man-DiC14MA和Man-DiC16MA兩種脂質(zhì)體分別在HepG2細(xì)胞和Hela細(xì)胞系中觀察其轉(zhuǎn)