陽離子化菊粉的合成及作為基因載體的研究.pdf

1、生物體的生命活動(dòng)都是由相應(yīng)基因所調(diào)控的，多種遺傳疾病都與基因的突變或異常有關(guān)，利用基因治療的手段來治療人類疾病已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)階段發(fā)展到臨床試用階段?；蛑委熓且环N從根本上治療疾病的方法?；蛑委煹年P(guān)鍵在于需要一個(gè)安全有效的載體攜帶基因進(jìn)入靶細(xì)胞，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。如何設(shè)計(jì)低毒高效的基因載體現(xiàn)如今已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)?；蜉d體分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但其毒性大、成本高且易于引起免疫原性及致瘤性，限制了其應(yīng)

2、用，須進(jìn)一步改進(jìn)。由于天然多糖具有毒性低、裝載量大、易于制備、生物相容性良好、易于進(jìn)行靶向修飾等優(yōu)點(diǎn)，近年來，很多學(xué)者以天然多糖為骨架，合成非病毒基因載體，用于RNA干擾或治療性基因的運(yùn)輸。
　　菊粉是一種細(xì)胞毒性低且具有生物可降解性的中性多糖，但修飾菊粉多糖作為基因載體的研究還很少。菊粉本身不帶電荷，不能與帶負(fù)電的DNA結(jié)合，可對(duì)其進(jìn)行陽離子化修飾以制備菊粉衍生物作為基因載體。因此本研究首次利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)技術(shù)

3、將甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)連接到菊粉多糖骨架上制備新型的基因載體。因此本論文工作主要著重于以下幾個(gè)方面:
　　本研究通過將二溴異丁酸(BMPA)偶聯(lián)到菊粉多糖(Inulin)上，合成了大分子多糖引發(fā)劑I-Br，從而利用ATRP技術(shù)將聚DMAEMA接枝在菊粉多糖骨架上，改變投料比，成功合成了具有不同DMAEMA重復(fù)單元數(shù)量的三種基因載體(PDIN1、PDIN2及PDIN3)。利用1HNMR對(duì)合成的載體進(jìn)行表征，

4、結(jié)果表明結(jié)構(gòu)正確。通過透射電子顯微鏡(TEM)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)觀察其微觀形態(tài)呈球形或近似球形的形狀，緩沖能力測試表明載體具有一定的運(yùn)載外源基因的能力。
　　通過粒徑分析儀測定載體/DNA復(fù)合物的粒徑及ξ-電位，三種取代度的PDIN/pDNA復(fù)合物在不同N/P下的粒徑均在30-130 nm之間，ζ-電位在2-12 mV之間。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明載體PDIN在體外條件下，對(duì)pDNA有很好的結(jié)合能力，有助于pDNA抵抗D

5、NA水解酶的水解。溶血實(shí)驗(yàn)表明在不同的時(shí)間和濃度情況下，三種取代度的PDIN溶血率低，有很好的血液相容性。PI競爭實(shí)驗(yàn)顯示三種載體均對(duì)pDNA有很好的結(jié)合能力，且DMAEMA單元越多的載體，與pDNA的結(jié)合能力越強(qiáng)。噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞毒性測試表明載體PDIN對(duì)MCF-7、HeLa、COS-7和HepG2細(xì)胞的毒性較小。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDIN能有效將表達(dá)綠色熒光蛋白(pEGFP)和β半乳糖苷酶(pβgal)的報(bào)告基因帶入COS-

6、7細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，在N/P為1時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，其β半乳糖苷酶的酶活為(3.36±0.74 U/mg蛋白)，比Lipo2000轉(zhuǎn)染效率(4.33±0.77 U/mg蛋白)略低。10％濃度血清存在時(shí)，轉(zhuǎn)染效率雖受到一定的影響，但仍能有效表達(dá)綠色熒光蛋白和β半乳糖苷酶。
　　凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明PDIN2可以與siRNA穩(wěn)定結(jié)合?；虺聊瑢?shí)驗(yàn)表明PDIN2/siEGFP可有效沉默綠色熒光蛋白的表達(dá)，且隨著N/P的增加，基因沉默的效果越好。10

7、％濃度血清的條件下，PDIN2/siRNA對(duì)綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)抑制作用有一定的影響，但仍能抑制綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)。內(nèi)攝實(shí)驗(yàn)表明PDIN2/siRNA可通過內(nèi)吞方式被細(xì)胞有效內(nèi)攝。
　　以上結(jié)果表明，對(duì)菊粉進(jìn)行陽離子化修飾制備基因載體能攜帶DNA或siRNA進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)蛋白或抑制相應(yīng)蛋白的表達(dá)。因此利用ATRP技術(shù)將P(DMAEMA)偶聯(lián)到菊粉多糖的聚合物有望成為一種新型的基因傳遞系統(tǒng)中的安全基因載體材