陽離子化食用菌P活性成分A作為納米基因傳遞載體的初步研究.pdf

1、近年來,基因治療已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。而基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是決定這一療法效果關(guān)鍵因素之一。病毒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)的載體,雖然病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,但是病毒載體存在著嚴(yán)重的安全隱患,而且生產(chǎn)成本高。非病毒載體與病毒載體相比,有著毒性低、免疫原性小、生產(chǎn)成本低、基因裝載容量大等優(yōu)點(diǎn)。天然活性成分A作為一種天然高分子材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性,幾乎無毒性和免疫原性,而且具有易于修飾,是制備非病毒基因載體的理想材料。本論文工作的目的是從一種食

2、用菌中提取活性成分A,并以此作為骨架材料,對(duì)其進(jìn)行陽離子化修飾,并對(duì)陽離子化產(chǎn)物進(jìn)行一系列表征,通過陽離子化合物與質(zhì)粒DNA的毒性試驗(yàn)和體外對(duì)大鼠骨髓干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試驗(yàn),檢測(cè)其毒性和轉(zhuǎn)染效率。
　　 本論文的工作是從食用菌P新鮮子實(shí)體中提取水溶性活性成分A。粗活性成分A經(jīng)脫蛋白后上DEAE-52纖維素層析柱,再經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析得到單一組分PPS。經(jīng)測(cè)定,PPS中糖醛酸含量為0.18％,PPS平均分子量為5.

3、49×105Da。根據(jù)薄層色譜的分析結(jié)果,PPS的單糖組分以葡萄糖為主,同時(shí)含有少量的半乳糖,甘露糖和鼠李糖。
　　 本文對(duì)PPS進(jìn)行了精胺陽離子化修飾并對(duì)陽離子化產(chǎn)物CPPS進(jìn)行了表征。CPPS的凍干品為乳白色粉末,具有良好的水溶性。通過三硝基苯磺酸(TNBS)法測(cè)得CPPS伯胺基的含量為3.21 mmol／g。經(jīng)傅立葉紅外光譜分析,從陽離子化前后的吸收峰變化,可以明顯看出,精胺已經(jīng)成功連接到PPS糖鏈上。
　　 本文

4、在實(shí)驗(yàn)室條件下制備了質(zhì)粒DNA,并經(jīng)紫外透射儀檢測(cè)質(zhì)粒在260nm和280nm處的光吸收值,得OD260／OD280值在1.8到1.9之間,符合轉(zhuǎn)染條件。我們還成功分離培養(yǎng)了大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,并以CPPS為載體構(gòu)建了CPPS-pDNA納米粒,對(duì)CPPS-pDNA納米粒的形態(tài)粒徑以及電位進(jìn)行了表征。透射電鏡觀測(cè),CPPS-pDNA納米粒在CPPS與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為20:1時(shí),呈均一圓球形,粒徑分布在20～50nm。
　　 為探

5、求適當(dāng)?shù)腃PPS與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比,本文對(duì)一系列不同質(zhì)量比(CPPS與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比分別為5:1,10:1,20:1,30:1,50:1,80:1)的CPPS／質(zhì)粒DNA納米粒進(jìn)行了瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,當(dāng)CPPS與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比增加到10:1時(shí),CPPS可以完全結(jié)合質(zhì)粒DNA,將質(zhì)粒DNA滯留在原孔。CPPS與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比分別為10:1,20:1,30:1時(shí),CPPS-pDNA復(fù)合物顆粒的粒徑分別為284.3nm、8

6、0.8nm、151.1 nm,Zeta電位分別為17mV、17.2mV、19.2mV。
　　 毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種CPPS—pDNA納米粒的細(xì)胞毒性均小于LipofectamineTM2000和PEI(25kDa)這兩種非病毒基因轉(zhuǎn)染對(duì)照試劑的毒性,說明本實(shí)驗(yàn)所制備的CPPS-pDNA納米粒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)細(xì)胞基本無毒性,安全性非常好。
　　 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,CPPS與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為20:1的CPPS-p