新型陽(yáng)離子聚合物聚磷酰胺的合成及作為基因-siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的目的是人工化學(xué)合成一種低毒、高效的樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物作為基因或siRNA的轉(zhuǎn)移載體，通過(guò)體外一系列的化學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其作為基因或siRNA的轉(zhuǎn)移載體的特性以及在多種細(xì)胞中對(duì)質(zhì)粒及siRNA的轉(zhuǎn)染效率以及在轉(zhuǎn)染過(guò)程中所產(chǎn)生的毒性作用。上述研究將為該陽(yáng)離子聚合物作為基因或siRNA的轉(zhuǎn)移載體用于臨床基因治療相關(guān)疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基

2、）-1，2-乙二胺在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，聚合48h，得到陽(yáng)離子聚磷酰胺(PPA)轉(zhuǎn)染試劑。然后通過(guò)過(guò)表達(dá)（質(zhì)粒）或干擾表達(dá)(si RNA)的策略探討聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD2表達(dá)質(zhì)粒在A549細(xì)胞（人類肺癌細(xì)胞系）和HEK293（人類胚胎腎細(xì)胞）中的轉(zhuǎn)染效率;通過(guò)CCK8檢測(cè)細(xì)胞在含有這種新型轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基中的增殖情況，確定它的細(xì)胞增殖毒性;經(jīng)免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、Western blot等方法證實(shí)聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD

3、2質(zhì)粒和siRNA進(jìn)入了細(xì)胞中，且能表達(dá)相應(yīng)的靶蛋白，導(dǎo)入的siRNA能靶向性敲低基因的表達(dá)，從而證實(shí)該新型陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑有良好的轉(zhuǎn)染效率。
　　研究結(jié)果：
　　1.聚磷酰胺聚合物的化學(xué)合成和核磁共振光譜測(cè)定
　　PPA是由二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺在氮?dú)獗Ｗo(hù)下聚合得到。PPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)由核磁共振光譜來(lái)(NMR spectra)鑒定。在聚合物1H NMR譜圖中，δ=4.512

4、-4.72ppm和1.09-1.31ppm處為亞甲基和甲基(-POCH2CH3)的氫質(zhì)子峰;δ=2.62-3.08ppm是亞甲基和甲基(-NCH2CH2)N(CH3)CH2CH2N-)的氫質(zhì)子峰。我們進(jìn)一步測(cè)定了聚合物的31p核磁共振光譜(31p NMR)。PPA的共振最高為δ=10.02 ppm，說(shuō)明二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺進(jìn)行縮聚得到聚磷酰胺。
　　2.聚磷酰胺結(jié)合DNA能力檢測(cè)

5、　　為了證明PPA對(duì)DNA的結(jié)合能力，即證明PPA和pDNA復(fù)合物的形成。用含EB(溴化乙錠)的1.0％的凝膠來(lái)進(jìn)行凝膠阻滯電泳，發(fā)現(xiàn)低濃度的PPA(0.5μg/μL)和高濃度的PPA（1μg/μL）分別與0.5μg的pDNA形成的聚合物顯示，在特定的N/P比率下PPA能夠有效的包裹pDNA，在N/P比率為8和更高的比率下PPA/pDNA會(huì)完全的滯留在上樣孔上。當(dāng)pDNA的濃度為1.0μg情況下，在比N/P為4或者更高的N/P比率時(shí)復(fù)合

6、物完全失去了移動(dòng)的能力，表明合成的聚磷酰胺能有效包裹DNA分子。
　　3.PPA/pDNA復(fù)合物顆粒大小和電極電位測(cè)定
　　PPA/pDNA多聚體混合物的粒子大小和電極電位已被證明影響細(xì)胞吸收，內(nèi)吞作用通路，入核作用和轉(zhuǎn)染效率[24，25]。多種不同重量比(N/P比率)的PPA/pDNA多聚體復(fù)合物的合成是通過(guò)將pDNA和PPA溶液在pH7.4的10 mMTris-HC1緩沖液中配成的。該P(yáng)PA/pDNA多聚體混合物不同重量

7、比(N/P比率)的顆粒大小和多聚復(fù)合物的電極電位測(cè)量是通過(guò)Nano-ZS ZEN3600檢測(cè)的。所有的PPA/pDNA多聚體混合物的大小測(cè)量范圍都是在1∶1至16∶1的重量比范圍，所有的PPA/pDNA多聚體混合物的直徑范圍大小在100到166nm之間。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著N/P比率增加，PPA/pDNA多聚體混合物的直徑會(huì)出現(xiàn)輕微的下降。
　　進(jìn)一步我們通過(guò)Nano-ZS ZEN3600的電極電位分析能力與動(dòng)態(tài)光散射能力來(lái)測(cè)定PPA

8、結(jié)合的質(zhì)粒DNA的電極電位，隨著PPA/pDNA多聚體混合物的N/P比率的增加，混合物的電壓也從26.6mv上升到38.4mv。由于核酸都是帶有負(fù)電荷的，通過(guò)靜電作用，因此帶有正電荷的PPA/pDNA多聚體混合物更加容易用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　4.聚磷酰胺(PPA)的細(xì)胞毒性檢測(cè)
　　為了探討PPA的毒性作用，我們進(jìn)行CCK-8毒性測(cè)試以期了解不同濃度的PPA對(duì)人類肺癌細(xì)胞A549和人類腎胚胎細(xì)胞HEK293的毒性作用。PPA的

9、測(cè)試濃度范圍是在15-30μg/mL。在PPA濃度為15μg/mL情況下，與DMSO對(duì)照組相比較，經(jīng)PPA處理的A549細(xì)胞和HEK293細(xì)胞在數(shù)量、形態(tài)等方面并未有明顯的不同。并且在PPA濃度為30μg/mL情況下，與DMSO對(duì)照組相比，A549細(xì)胞和HEK293細(xì)胞仍然具有相對(duì)較低的毒性，并且我們發(fā)現(xiàn)PPA在HEK293細(xì)胞中比在A549細(xì)胞中具有較低的毒性。
　　為了進(jìn)一步明確PPA的毒性與孵育時(shí)間的相關(guān)性，HEK293細(xì)胞

10、在PPA濃度為15μg/mL時(shí)，分別孵育12h，24h，36h。在不同的時(shí)間段，我們發(fā)現(xiàn)在15μg/mLPPA濃度下，HEK293細(xì)胞和DMSO對(duì)照組相比并沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。綜上所述，PPA體外測(cè)試表明PPA細(xì)胞毒性作用低從而有望成為理想的體內(nèi)或者是體外基因轉(zhuǎn)移載體。
　　5.聚磷酰胺(PPA)介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和生物功能活性檢測(cè)
　　我們利用PPA包裹帶有GFP標(biāo)簽的pEGFP質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。熒光顯微鏡顯示

11、在N/P比率為3∶1時(shí)，PPA顯示出與商用化的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和Hilymax相比較的轉(zhuǎn)染效率和相似的GFP熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞儀進(jìn)一步定量顯示PPA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFP的熒光量達(dá)64％，與Lipofectamine2000(62％)相當(dāng)，而高于Hilymax(48％)。
　　PKD的磷酸化可特異性激活NF-κB信號(hào)通路，其中IκB的降解是NF-κB信號(hào)通路激活的關(guān)鍵[26-28]。為此，我們使用PKD的特異

12、性激動(dòng)劑PMA作刺激因子，探討PPA包裹的外源性質(zhì)粒PKD2的轉(zhuǎn)染，是否能有效表達(dá)PKD2蛋白，該蛋白是否受PMA的激活，繼而激活下游NF-KB信號(hào)通路。Western blot檢測(cè)表明，PPA能有效將外源性的GFP-PKD2質(zhì)粒高效的轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549細(xì)胞中，并且過(guò)表達(dá)PKD2。同時(shí)，PMA處理細(xì)胞30min后，能明顯提高內(nèi)源性和外源性PKD在 S744/748磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平，而且，在PMA的刺激下，外源性GFP-PKD2的過(guò)表

13、達(dá)明顯降低IκB的表達(dá)水平，表明PKD的表達(dá)和激活促進(jìn)IκB的降解。上述研究提示PPA能夠有效的轉(zhuǎn)移外源基因到靶細(xì)胞內(nèi)，并有效地表達(dá)和激活下游信號(hào)通路，從而在細(xì)胞中執(zhí)行特定的功能。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)PPA是否可以同時(shí)包裹多個(gè)外源基因，且高效地轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞中，并在細(xì)胞中仍具有生物功能活性。我們利用PPA包裹，然后將NF-KB熒光酶素報(bào)告基因（NF-κB-luc）及內(nèi)參照?qǐng)?bào)告基因海腎熒光素酶[pGL4.74(hRluc/TK)]分別

14、與pEGFP、GFP-PKD2共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。血清饑餓16小時(shí)后，兩組細(xì)胞在有無(wú)PMA的刺激作用下處理12小時(shí)，收集細(xì)胞裂解液，進(jìn)行雙色熒光素酶活性檢測(cè)。各組細(xì)胞的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值用相對(duì)熒光素酶活性(RLU)表示。結(jié)果表明，與pEGFP轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，GFP-PKD2的表達(dá)明顯增加PMA刺激的NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活活性。上述結(jié)果提示PPA能有效地包裹和轉(zhuǎn)染多個(gè)外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞，外源基因的表達(dá)和激活能有

15、效地促進(jìn)下游信號(hào)通路的激活，進(jìn)而最終促進(jìn)與之相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　6.PPA介導(dǎo)的siRNA的轉(zhuǎn)染及蛋白核轉(zhuǎn)位檢測(cè)
　　為了進(jìn)一步證實(shí)PPA是否同樣具有包裹并有效轉(zhuǎn)染siRNA，我們同樣將PPA和siRNA以一定的比率(N/siRNA)混合，然后將其轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，孵育2天。Western blotting檢測(cè)顯示:在A549和HeLa細(xì)胞中，經(jīng)PPA導(dǎo)入的siRNA-PKD2均能明顯地敲低

16、內(nèi)源性PKD2的表達(dá)。為了進(jìn)一步明確敲低內(nèi)源性PKD2的表達(dá)是否影響TNF-α生理刺激作用對(duì)NF-κB的核轉(zhuǎn)位，我們用PPA分別包裹siCTL（對(duì)照siRNA）和siPKD2并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，48小時(shí)后，分別在有無(wú)TNF-α作用下處理細(xì)胞12h，免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)PPA轉(zhuǎn)染的siPKD2能夠明顯降低TNF-α介導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果表明新合成的PPA不僅能夠有效地轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

17、到靶細(xì)胞中，而且也能夠與siRNA形成復(fù)合物，將siRNA有效導(dǎo)入靶細(xì)胞，并靶向敲低內(nèi)源性靶基因的表達(dá)，從而有效降低下游信號(hào)分子的功能作用（入核）。
　　結(jié)論:
　　本研究中，我們研制開(kāi)發(fā)出一種新型的陽(yáng)離子聚合物-聚磷酰胺(PPA)。該陽(yáng)離子聚合物在相對(duì)低的重量比的情況下可以有效地包裹DNA和siRNA。而且其具有較小尺寸的體積和較大的電動(dòng)勢(shì)能。在不同的細(xì)胞中進(jìn)行的細(xì)胞毒性測(cè)試和體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PPA不僅細(xì)胞毒性低而且