2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤。根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告稱(chēng),2012年全球新增肝癌患者74.8萬(wàn)人,同時(shí)死亡69.5萬(wàn)人,新增發(fā)病率排名第六,死亡率則排名第三。目前,我國(guó)肝癌預(yù)防和診斷治療形勢(shì)仍然十分嚴(yán)峻。
  Galectin-3是一個(gè)與HCC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白。在健康的肝組織中,肝細(xì)胞并不表達(dá)Galectin-3,但發(fā)生癌變的肝組織中,Galectin-3的表達(dá)是明顯上調(diào)的。在肝癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Galectin-3

2、會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和侵襲能力的增強(qiáng)。細(xì)胞內(nèi)Galectin-3主要發(fā)揮類(lèi)似BCL-2家族蛋白的抗凋亡功能。在細(xì)胞外空間中,Galectin-3可以與大量的糖基化蛋白結(jié)合。依賴(lài)于Galectin-3的N端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的寡聚作用,這些糖基化受體與Galectin-3在細(xì)胞表面形成了穩(wěn)定的晶格狀結(jié)構(gòu),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。
  一種 N端結(jié)構(gòu)域缺失的Galectin-3的特殊形式僅包含了 Galectin-3的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(Carbohydra

3、te recognition domain,CRD),簡(jiǎn)稱(chēng)Gal3C,僅存在于細(xì)胞外。目前的研究發(fā)現(xiàn), Gal3C可能在血管生成方面發(fā)揮作用,并具備一定的抑制早期腫瘤生長(zhǎng)的作用。目前, Gal3C對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。
  本論文針對(duì)Gal3C在HCC細(xì)胞外的功能以及其發(fā)揮功能的機(jī)制進(jìn)行了研究,主要的研究目的是:1.發(fā)現(xiàn)Gal3C在HCC細(xì)胞系HepG2表面的潛在配體;2.發(fā)現(xiàn)Gal3C對(duì)表達(dá)Galectin-3

4、的HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)有何種影響;3.發(fā)現(xiàn)Gal3C發(fā)揮其調(diào)控功能的分子機(jī)制。
  本論文結(jié)合原核共表達(dá)與光反應(yīng)交聯(lián)策略、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段以及高通量的生物質(zhì)譜依賴(lài)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略,對(duì) Gal3C在 HepG2細(xì)胞外表面的潛在配體、Gal3C對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)遷移和增殖的影響、Gal3C對(duì)HepG2細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制展開(kāi)研究。
  在本論文的第一部分主要研究了Gal3C在HepG2細(xì)胞表面的定位以及在細(xì)胞表面結(jié)合的潛

5、在配體。結(jié)合原核共表達(dá)策略和光反應(yīng)活性代謝標(biāo)記策略,表達(dá)了生物素標(biāo)記的Gal3C重組蛋白Gal3CB以及生物素化/光反應(yīng)亮氨酸雙重標(biāo)的Gal3C重組蛋白Gal3CBP,并證明Gal3CBP具備了結(jié)合乳糖的能力。將Gal3CBP與HepG2細(xì)胞孵育,并用紫外線進(jìn)行交聯(lián),然后用FITC熒光顯色,顯示Gal3CBP主要結(jié)合在細(xì)胞表面,在細(xì)胞與細(xì)胞的連接處有聚集的趨勢(shì)。隨后用鏈霉親和素親和層析純化了交聯(lián)的細(xì)胞組分,對(duì)這些組分進(jìn)行胰蛋白酶酶解、質(zhì)

6、譜檢測(cè)和Proteome Discoverer1.4數(shù)據(jù)庫(kù)搜索分析,發(fā)現(xiàn)Gal3CBP能結(jié)合細(xì)胞膜上的糖基化蛋白。這些糖蛋白有的是膜上的受體,例如:表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR),轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體(MPRI)、六磷酸甘露糖受體(MPRD)和甘露糖受體(MRC2)。另外,溶酶體相關(guān)膜糖蛋白(LAMP2),細(xì)胞表面黏附分子如整合蛋白(Integrin)家族蛋白、基質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)受體1(NPTN),活性白細(xì)胞黏附分子

7、(ALCAM)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(L1CAM)等與細(xì)胞黏附有關(guān)的分子也是Gal3C的結(jié)合對(duì)象。
  第一部分的研究結(jié)果顯示,通過(guò)用具有光反應(yīng)交聯(lián)活性和生物素標(biāo)記的Gal3CBP,并利用質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)了一些之前并未報(bào)道的Gal3C的結(jié)合組分,它們也是 Galectin-3在HepG2細(xì)胞膜表面的潛在配體。
  本論文第二部分的研究研究了細(xì)胞外的Gal3CB對(duì)HepG2產(chǎn)生的影響。將Gal3CB添加到HepG2的培養(yǎng)體系中,然后

8、用MTT實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)HepG2生長(zhǎng)的影響,用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和 Trans-well實(shí)驗(yàn)分析其對(duì) HepG2的生長(zhǎng)和增殖的影響。結(jié)果顯示,細(xì)胞外過(guò)量的Gal3CB能夠抑制HepG2的生長(zhǎng),抑制效果隨著抑制劑量和時(shí)間的增加而增加,50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細(xì)胞12小時(shí),能使生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%。劃痕修復(fù)結(jié)果顯示,細(xì)胞外過(guò)量的Gal3CB能夠減弱HepG2的遷移。用10μg/ml的Gal3CB處理HepG2細(xì)胞12小時(shí)后,Hep

9、G2的遷移就受到了明顯的抑制。Trans-well實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞外的Gal3C能夠抑制HepG2細(xì)胞的侵襲能力,抑制效果隨著抑制劑量的增加而增加。
  第二部分的研究結(jié)果顯示,如細(xì)胞外出現(xiàn)大量的Gal3C,則 HepG2的生長(zhǎng)、遷移和侵襲都會(huì)受到一定程度的抑制。這說(shuō)明,Gal3C對(duì)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
  本論文第三部分的研究?jī)?nèi)容研究了50μg/ml的Gal3CB處理HepG2細(xì)胞12小時(shí)后,細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)

10、譜的動(dòng)態(tài)變化,并探討 Gal3CB對(duì) HepG2細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。首先,利用13C(6)-Lysine和13(6)-Arginine對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行SILAC標(biāo)記,使輕重標(biāo)記的細(xì)胞的相同肽段之間能夠產(chǎn)生6.03 Da的質(zhì)量差,并以此作為相對(duì)定量的基礎(chǔ)。然后,分別用Gal3C處理重標(biāo)細(xì)胞或輕標(biāo)細(xì)胞,并將處理前后的細(xì)胞等量混合,混合后的蛋白進(jìn)行胰蛋白酶酶切和LC-MS/MS鑒定,以獲得蛋白的表達(dá)譜以及定量信息。利用在線數(shù)據(jù)分析軟件DAVI

11、D Bioinformatics Resources6.8對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行基因分類(lèi)和信號(hào)通路分析,用IBM SPSS Statistics19對(duì)蛋白的定量信息和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用在線的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)處理軟件String10對(duì)上下調(diào)的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)間的相互作用預(yù)測(cè),以發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生變化的蛋白之間是否存在已經(jīng)報(bào)道的或者預(yù)測(cè)的相互作用。用 WebGestalt中的Disease Association Analysis工具對(duì)這些差異表

12、達(dá)的基因進(jìn)行預(yù)測(cè),以探索它們與疾病的可能關(guān)系。用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)了差異表達(dá)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。分析結(jié)果顯示,在相對(duì)應(yīng)的兩次正反標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中,分別鑒定到肽段數(shù)為30488和29309,蛋白數(shù)為4705和4435,重復(fù)鑒定到3703個(gè)蛋白,其中,在兩次實(shí)驗(yàn)中均有定量信息的蛋白有3182個(gè)。鑒定到的蛋白涉及代謝途徑、小分子代謝、蛋白質(zhì)結(jié)合以及細(xì)胞外泌體。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,兩次實(shí)驗(yàn)的均值為1.0188和1.0068,標(biāo)準(zhǔn)差為0

13、.25133和0.17903。兩次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分布直方圖的偏度的標(biāo)準(zhǔn)誤差均為0.043,峰度的標(biāo)準(zhǔn)誤差均為0.087,兩組數(shù)據(jù)的雙側(cè)T檢驗(yàn)P值<0.01,說(shuō)明數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩組數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.414,說(shuō)明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性良好,符合實(shí)驗(yàn)要求。
  選擇蛋白表達(dá)量上下調(diào)范圍為均值的1.3倍,作為Gal3CB處理后,HepG2中表達(dá)出現(xiàn)變化趨勢(shì)的蛋白。在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下,有35個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了上調(diào),67個(gè)蛋白的表達(dá)發(fā)生

14、了下調(diào)。其中,上調(diào)達(dá)到均值1.5倍的蛋白有11個(gè),下調(diào)達(dá)到1.5倍的蛋白有24個(gè)。這些蛋白總的差異表達(dá)趨勢(shì)是,負(fù)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞黏附的蛋白表達(dá)量是明顯上調(diào)的,正調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞黏附的蛋白的表達(dá)量是明顯下調(diào)的,符合本論文第二部分的細(xì)胞生物學(xué)結(jié)論。
  String10分析發(fā)現(xiàn),與GalCB存在相互作用或者可能發(fā)生相互作用的蛋白,大部分都與腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)。WebGestalt分析結(jié)果顯示,Gal3CB刺激下表達(dá)發(fā)生差異變化的蛋

15、白可以分為兩組。一組與代謝相關(guān)疾病存在密切關(guān)系,另一組則與腫瘤相關(guān)。NDRG1不僅與腫瘤密切相關(guān),也肝移植有密切關(guān)系,說(shuō)明其可能與肝臟腫瘤存在關(guān)系。TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在上調(diào)表達(dá)的蛋白中,有7個(gè)蛋白至少具有單次跨膜結(jié)構(gòu),在下調(diào)表達(dá)的蛋白中,至少具有單次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白有16個(gè),其中ALCAM是一個(gè)下調(diào)表達(dá)的跨膜蛋白,并與腫瘤密切相關(guān)。對(duì)鑒定到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證,結(jié)果顯示,NDRG1、CLU以及AL

16、CAM的下調(diào)表達(dá)以及S100A11、MVP和Galectin-1的上調(diào)表達(dá)均與定量蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定結(jié)果相符合。已有的研究證實(shí),NDRG1、CLU以及ALCAM的下調(diào)表達(dá)以及S100A11的上調(diào)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制,這與之前的研究結(jié)論相符合。同時(shí),在這些蛋白中,NDRG1對(duì)抗腫瘤藥物達(dá)沙替尼的敏感度最大。
  第三部分的研究結(jié)果顯示,通過(guò)研究Gal3CB處理HepG2細(xì)胞后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)了Gal3C負(fù)

17、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的功能可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NDRG1、CLU、ALCAM、S100A11、MVP以及Galectin-1等的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的。并發(fā)現(xiàn)Gal3C抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的機(jī)制與達(dá)沙替尼具有一定的一致性。
  本課題主要取得了一下創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn):
  1)利用代謝標(biāo)記對(duì)Gal3C進(jìn)行光反應(yīng)活性氨基酸標(biāo)記,使之具備了光反應(yīng)交聯(lián)能力,實(shí)際成為了一個(gè)研究Galectin-3配體的生物探針;
  2)首次證實(shí)細(xì)胞外Gal3C是一個(gè)Hep

18、G2的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的負(fù)調(diào)控因子;
  3)發(fā)現(xiàn)并初步闡述了細(xì)胞外Gal3C抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,細(xì)胞外Gal3C能夠調(diào)控與HepG2轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因,NDRG1、CLU、ALCAM、MVP、S100A11以及Galectin-1的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)NDRG1對(duì)抗腫瘤藥物達(dá)沙替尼的敏感度很高;
  4)發(fā)現(xiàn)了一組未經(jīng)報(bào)道過(guò)的Galectin-3在HCC細(xì)胞表面的潛在受體群。
  本論文的研究結(jié)論使我們獲得了Gal3C調(diào)控HC

19、C生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制的較為清晰的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞外Gal3C能夠結(jié)合到HepG2細(xì)胞表面,從而抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Gal3C對(duì)HepG2的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制可能包括:1)直接影響細(xì)胞表面的粘附分子如ALCAM的表達(dá);2)抑制細(xì)胞內(nèi)的能量代謝水平;3)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)與生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因,如 NDRG1、S100A11等的表達(dá)。
  Gal3C對(duì) HCC的調(diào)控是多方向,其詳細(xì)機(jī)制仍然具有深入研究的價(jià)值。本論文僅從生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)角度,對(duì)其

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