TIMP-3N端結(jié)構(gòu)域重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：組織金屬蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3)在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。但是，TIMP-3 N端結(jié)構(gòu)域(N-TIMP3)蛋白對(duì)胰腺癌的作用還不清楚。本課題擬構(gòu)建與鑒定N-TIMP3重組腺病毒載體，為以后深入研究N-TIMP3對(duì)胰腺癌的作用奠定基礎(chǔ)。另外，還擬構(gòu)建與鑒定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent pr

2、otein，EGFP)重組腺病毒載體，作為重組腺病毒載體構(gòu)建過程中的系統(tǒng)陽性對(duì)照。 方法:分別將編碼N-TIMP3與EGFP的DNA片段定向克隆至穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-N-TIMP3與pShuttle-EGFP。將上述穿梭質(zhì)粒Pme I線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-N-TIMP3與pAd-EGFP。分別將Pac I線性化的重組腺病

3、毒載體轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，獲得重組腺病毒Ad-N-TIMP3與Ad-EGFP。上述重組腺病毒經(jīng)過兩次感染QBI-293A細(xì)胞而擴(kuò)增后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(tissue culture infectious dose 50，TCID50)法檢測滴度。最后，將重組腺病毒Ad-N-TIMP3與Ad-EGFP分別感染胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞后，通過Western blot的方法檢測TIMP-3 N端結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)，以及通過熒光倒

4、置顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:穿梭質(zhì)粒pShuttle-N-TIMP3與 pShuttle-EGFP經(jīng)過鑒定，被確認(rèn)成功構(gòu)建；相應(yīng)的重組腺病毒載體pAd-N-TIMP3與pAd-EGFP經(jīng)過鑒定，也被確認(rèn)成功同源重組。將上述重組腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，能夠觀察到細(xì)胞致病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。重組腺病毒Ad-N-TIMP3與Ad-EGFP經(jīng)兩次擴(kuò)增后，滴度分別達(dá)到5×108