結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達(dá)、免疫特性分析及在牛結(jié)核病檢測(cè)中的初步應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)復(fù)合物引起的一類以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性人獸共患傳染病病。該復(fù)合物主要成員包括主要引起人TB的MTB以及引起牛結(jié)核病的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)。上世紀(jì)80年代以來(lái),由于人口增長(zhǎng)、移民、HIV共感染及耐藥強(qiáng)毒株廣泛傳播等因素的影響,TB在世界范圍內(nèi)再次流行。估計(jì)全球有20億

2、人感染,活動(dòng)性肺結(jié)核病人2000余萬(wàn),且每年新增800-900萬(wàn)TB病例,死亡200萬(wàn)人左右。牛結(jié)核病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康發(fā)展,同樣也會(huì)導(dǎo)致部分人TB的發(fā)生。作為主要疾病負(fù)擔(dān)和致死因素之一,TB日益成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題并引起國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。
　　 TB防控需要有效的疫苗和特異性診斷試劑?？ń槊?BCG)作為人類唯一使用的抗TB疫苗在兒童TB和彌散性TB中效果良好,但對(duì)成人肺結(jié)核保護(hù)效果不佳(0-80％),且BCG

3、免疫會(huì)干擾TB的皮試診斷。因此,鑒定病原特異性的抗原對(duì)發(fā)展新型抗TB保護(hù)性疫苗和特異性診斷試劑顯得尤為必要。比較基因組學(xué)等的發(fā)展提供了大量特異性抗原信息,它們的免疫特性評(píng)價(jià)常用于鑒定新型抗TB疫苗候選抗原和診斷試劑。本研究應(yīng)用原核系統(tǒng)表達(dá)和純化了7種結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白,對(duì)其中5種重組蛋白進(jìn)行了免疫特性分析,同時(shí)利用間接ELISA方法,評(píng)價(jià)和比較其在牛結(jié)核病血清學(xué)診斷中的潛能。
　　 1.結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白的表達(dá)和鑒定

4、　　 參考比較基因組學(xué)信息,選取6種MTB抗原蛋白(MPT64、MPT63、MPT83、CFP32、MPT51和MPT53),首先通過(guò)PCR擴(kuò)增相應(yīng)的編碼基因序列,經(jīng)克隆篩選和測(cè)序鑒定正確后,利用pET30a質(zhì)粒構(gòu)建原核表達(dá)載體。將鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,再以IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)以胞內(nèi)可溶性表達(dá)的上述6種抗原蛋白及ESAT-CFP10融合蛋白(本室保存)進(jìn)行親和層析純化。定量測(cè)定和分析

5、純化產(chǎn)物濃度和純度,并通過(guò)Western blotting試驗(yàn)分析融合蛋白的免疫原性。
　　 SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后各目的蛋白均成功表達(dá),且主要以可溶形式存在,灰度分析顯示各目的蛋白表達(dá)量約占裂解上清總蛋白的30％左右(分別為34.8％、32.7％、27.4％、27.8％、30.6％、31.5％和30.2％),而純化后融合蛋白的純度,除MPT53(69.8％)外其余均在90％以上(其中MPT64為92.7％、MPT63為

6、95.6％、MPT83為96.6％、CFP32為91.8％、MPT51為92.3％、ESAT-6-CFP10為96.6％)。Western blotting結(jié)果顯示,在各融合蛋白處均出現(xiàn)特異性目的條帶,表明其具有較好的免疫反應(yīng)性。
　　 2.五種融合蛋白的細(xì)胞免疫學(xué)特性分析
　　 以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠,二免兩周后取脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行

7、免疫學(xué)測(cè)定。將淋巴細(xì)胞直接標(biāo)記PE-CD4/CD69-FITC和APC-CD8α/CD69-FITC利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá),結(jié)果顯示五種蛋白均能引起兩類淋巴細(xì)胞亞群CD69表達(dá)量上調(diào),且MPT63和ESAT-6-CFP10刺激CD4+細(xì)胞表達(dá)CD69的能力顯著高于其他幾種蛋白。利用ELISPOT試驗(yàn)分析五種蛋白作刺激劑活化淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10與MPT

8、63刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力最強(qiáng),ESAT-6-CFP10和CFP32刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的能力最強(qiáng),而MPT64刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力在所有蛋白中最弱。比較同一種蛋白活化特異淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的能力,結(jié)果顯示ESAT-6-CFP10和MPT63蛋白刺激細(xì)胞分泌IFN-γ的能力顯著大于IL-4,呈Th1免疫應(yīng)答趨勢(shì);MPT83和MPT64蛋白則相反,呈Th2免疫應(yīng)答趨勢(shì):而CFP32蛋白刺激細(xì)胞分泌兩種

9、細(xì)胞因子的能力相當(dāng),呈現(xiàn)Th1/Th2免疫平衡趨勢(shì)。同時(shí),通過(guò)夾心ELISA方法對(duì)各融合蛋白刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4含量進(jìn)行定量分析,也得到與ELISPOT試驗(yàn)相似的結(jié)果。
　　 3.五種融合蛋白的牛結(jié)核診斷價(jià)值評(píng)價(jià)
　　 在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中,以ESAT-CFP10、MPT64、MPT63、MPT83、CFP32五種融合蛋白作為刺激原,與PPD同步刺激臨床采集的25份奶牛尾靜脈血,再用IFN-γ試劑盒

10、檢測(cè)其活化抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。均值和線性回歸分析的結(jié)果顯示5種蛋白中ESAT-6-CFP10刺激IFN-γ的產(chǎn)生與Bovine PPD的相關(guān)性最高,MPT63蛋白的相關(guān)性次之。以0.280作為蛋白刺激陽(yáng)性反應(yīng)的切割值,其陽(yáng)性率與試劑盒陽(yáng)性符合率由高到低依次為ESAT-6-CFP10、MPT63、MPT83、MPT64和CFP32。
　　 同時(shí)以上述5種蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA方法,通過(guò)檢測(cè)臨床牛血漿上

11、清中特異性抗體以評(píng)價(jià)它們用于牛結(jié)核血清學(xué)診斷的潛在應(yīng)用價(jià)值。各蛋白的陽(yáng)性檢出率如下:MPT64為8.40％(20/238),MPT63為9.66％(23/238),MPT83為17.65％(42/238),CFP32為11.34％(27/238),ESAT-6-CFP10為2.52％(6/238),顯示MPT83和CFP32血清學(xué)檢測(cè)的敏感性較高。將各蛋白的間接ELISA結(jié)果與IFN-γ試劑盒的結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩種方法的陰性符合率