牛分枝桿菌MPB83基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、牛結(jié)核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種以呼吸道病變?yōu)橹鞯穆赃M(jìn)行性傳染病。MPB83蛋白是牛分枝桿菌培養(yǎng)早期分泌到上清中的一種分泌性脂蛋白，在牛分枝桿菌中高水平表達(dá)，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性。為觀察重組MPB83蛋白的免疫活性，揭示該蛋白在牛結(jié)核病的診斷和防治中的作用，本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了牛分枝桿菌MPB83基因，利用分子克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)了MPB83蛋

2、白在大腸桿菌中的表達(dá)，并對重組蛋白進(jìn)行了純化和免疫印跡分析，為進(jìn)一步研究其在牛結(jié)核病診斷中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 首先，本實(shí)驗(yàn)參照Gerd3ank中發(fā)表的牛分枝桿菌AF2122/97株MPB83基因序列，設(shè)計(jì)合成一對帶酶切位點(diǎn)的引物，對MPB83基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現(xiàn)一條約600bp的特異性條帶，將其回收后克隆到pGEM-T Easy載體中，構(gòu)建出克隆載體pGEM-MPB83，經(jīng)測序鑒定后，將目的基因

3、亞克隆至表達(dá)載體pET-30a中，得到陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-MPB83。 將重組質(zhì)粒pET30a-MPB83轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，該融合蛋白以包涵體的形式表達(dá)，其分子量約為26kDa，蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的20％，從而實(shí)現(xiàn)了MPB83重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)。Western-Blot檢測表明，表達(dá)的融合蛋白可被牛分枝桿菌陽性血清所識