鴨疫里氏桿菌野生型質(zhì)粒的分離、序列分析和DPP IV缺失株的構(gòu)建.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種以敗血性滲出為主要特征的傳染病。臨床剖檢癥狀主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎或氣囊炎,部分病例出纖維素性腦膜炎、輸卵管炎或關(guān)節(jié)炎。該病給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前已報(bào)道的鴨疫里氏桿菌血清型有21種,各血清型之間交叉保護(hù)率低,使得疫苗免疫防治比較難以進(jìn)行。在大多數(shù)鴨場,鴨疫里氏桿菌感染一旦發(fā)生很難徹底清除

2、,呈現(xiàn)持續(xù)性感染的狀態(tài)。因此加強(qiáng)RA分子生物學(xué)、致病和免疫機(jī)制的研究,對(duì)從根本上防治該病的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究利用堿裂解法抽提RA臨床分離株野生型質(zhì)粒,通過酶切分析,引物延伸的方法獲得質(zhì)粒的全序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為質(zhì)粒改造奠定基礎(chǔ)。另外利用自殺性載體首次成功構(gòu)建了RA-YM菌株的DPPⅣ缺失株,為進(jìn)一步研究DPPⅣ在RA致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究取得的結(jié)果如下:
　　 1.鴨疫里氏桿菌

3、野生型質(zhì)粒的分離、序列分析
　　 應(yīng)用堿裂解方法,對(duì)鴨疫里氏桿菌臨床分離株RA-JX進(jìn)行質(zhì)粒抽提,獲得了純度較高的質(zhì)粒。采用XbaⅠ限制性酶切,膠回收酶切片段,再與同樣酶切的載體pUC18連接,得到的陽性克隆送去測序,再用引物延伸的方法,測定整個(gè)質(zhì)粒的序列。分析結(jié)果顯示,RA-JX菌株中含有的質(zhì)粒大小為8048 bp。
　　 對(duì)質(zhì)粒pRA-JX進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括質(zhì)粒全序列的ORF的搜索,ORF的同源性比較,復(fù)制子的

4、分析等。質(zhì)粒pRA-JX上存在著分別編碼Rep-3,Transposase.11,COG2378和Cas2_Ⅰ_Ⅱ_Ⅲ的主要ORF。對(duì)質(zhì)粒pRA-JX ORF之外的序列BlastN比對(duì)、分析,推測質(zhì)粒pRA-JX的復(fù)制子,包括質(zhì)粒的復(fù)制起始蛋白以及其上游的一段序列,大小為2449 bp。本試驗(yàn)為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究鴨疫里氏桿菌提供了技術(shù)支持。
　　 2.鴨疫里氏桿菌血清1型云夢(mèng)分離株DPPⅣ缺失株的構(gòu)建
　　 參照

5、鴨疫里氏桿菌血清1型云夢(mèng)分離株DPPⅣ序列,從RA-YM基因組中擴(kuò)增出DPPⅣ同源臂片段,在其同源臂之間插入壯觀霉素抗性基因,連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上,構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pRE-LSR。重組自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌X7213,以大腸桿菌X7213陽性克隆為供體菌,與受體菌RA-YM進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移,涂布?jí)延^霉素(Spc)抗性平板篩選出Spc抗性的接合子,并用PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中。本試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究RA的分子致病