鴨疫里默氏桿菌脂多糖隨機突變株的篩選及M949_1360基因生物學特性分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）為革蘭氏陰性小桿菌，可引起鴨、鵝、火雞等家禽和野禽的急性敗血性和滲出性炎癥，又稱為鴨傳染性漿膜炎。本病在世界各地均有流行，可引發(fā)較高的發(fā)病率及死亡率，是當前造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟損失的主要細菌性傳染病之一。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，參與識別宿主的免疫系統(tǒng)，并在對宿主的致病性方面起著重要作用。
　　本研究用

2、鴨疫里默氏桿菌血清1型CH3菌株作為免疫原，純化后的CH3 LPS作為包被抗原，依據(jù)間接ELISA的方法對細胞融合后的雜交瘤細胞進行篩選，成功獲得一株CH3LPS的單克隆抗體并命名為1C1。通過抗體分型試劑盒測定LPS單克隆抗體1C1為Ig亞類IgG3，腹水效價為1∶3200。本研究通過間接ELISA的方法，用單抗1C1作為一抗，對本實驗室前期構(gòu)建的1462株RA CH3轉(zhuǎn)座子隨機突變株進行LPS突變株的篩選，成功篩選出一株對LPS單抗

3、1C1呈陰性反應(yīng)的突變株RA△604。Southern blot實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子Tn4351在突變株RA△604基因組中為單次插入，轉(zhuǎn)座子插入的基因為M9491360基因。BLAST分析結(jié)果表明，M9491360基因在鴨疫里默氏桿菌中高度保守，與DSM15868，RA-GD, ATCC11845=DSM15868, RA-CH-2,17,153, Yb2和RA-CH-1具有98％-100％的同源性。
　　對突變株RA△604的研

4、究發(fā)現(xiàn)，失活M949_1360基因后，其上、下游基因的轉(zhuǎn)錄沒有顯著差異，表明RA△604 M949_1360基因的失活對其上、下游基因的轉(zhuǎn)錄沒有極性效應(yīng)。對純化的LPS進行銀染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株CH3相比，突變株RA△604 LPS缺少了兩條分子量大約在21、15 kDa大小的條帶，表明突變株RA△604的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，預(yù)示著失活的M9491360基因與LPS合成相關(guān)。對構(gòu)建的回復株cRA604進行全菌Westernblot，

5、發(fā)現(xiàn)單抗1C1反應(yīng)條帶在互補株得到回復，而在突變株RA△604為缺失，表明回復株cRA604的LPS表型有一定程度的回復。
　　依據(jù)體內(nèi)和體外兩個方面的實驗，對突變株RA△604進行致病性及其致病機制的研究。動物試驗結(jié)果表明突變株RA△604的半數(shù)致死量(LD50)大于1010 CFU，與野生株CH3的LD50(4.47×107 CFU)相比，減毒約200倍以上。體內(nèi)菌血計數(shù)試驗發(fā)現(xiàn)突變株RA△604在感染后5天內(nèi)血液中細菌菌量呈

6、現(xiàn)逐漸下降趨勢，而野生株CH3在感染后前三天出現(xiàn)了明顯的血液載菌量增加的趨勢，之后隨時間推移血液的載菌量開始下降。實驗結(jié)果顯示，突變株RA△604在鴨體內(nèi)的生存能力明顯下降，對正常鴨血清的抵抗力試驗結(jié)果表明缺失株的耐受力比野生株強，這可能是由于M949_1360基因的失活改變了細菌外膜結(jié)構(gòu)從而使突變株降低了補體介導的殺傷作用。對突變株RA△604粘附和入侵Vero細胞的能力進行檢測發(fā)現(xiàn)，細菌的粘附和入侵能力都有顯著的下降?；貜椭阠RA6