鴨疫里默氏桿菌雙重PCR方法的建立及50S L27轉(zhuǎn)座子插入突變株的部分生物學(xué)特性分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌感染（Riemerella anatipestifer infection）是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一，主要感染鴨、鵝等多種禽類的接觸性傳染疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎。該病是由黃桿菌科里默氏桿菌屬的鴨疫里默氏桿菌引起的，感染鴨會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，消瘦，飼料轉(zhuǎn)化率降低，肉品質(zhì)下降，及高死亡率等癥狀，在養(yǎng)殖和疾病的治療等方面給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　目前確認(rèn)的鴨疫里默氏桿菌的血清型至少有21個(gè)，公布在GenB

2、ank上的就有9株鴨疫里默氏桿菌的全基因序列。鴨疫里默氏桿菌的編碼基因超過(guò)2000個(gè)，而目前已研究的只有其中的極少數(shù)?，F(xiàn)階段控制鴨疫里默氏桿菌病的主要方法是注射疫苗和抗菌性藥物，而絕大部分鴨疫里默氏桿菌菌株對(duì)卡那霉素有抗藥性，因此本研究通過(guò)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)，來(lái)篩選和鑒定鴨疫里默氏桿菌對(duì)卡那霉素耐藥相關(guān)的基因。
　　試驗(yàn)一是根據(jù)鴨疫里默氏桿菌CH3株dnaB基因和16S rRNA的序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了雙重PCR檢

3、測(cè)方法。采用方陣法對(duì)雙重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化改造，優(yōu)化的反應(yīng)退火溫度為60℃。試驗(yàn)結(jié)果表明，該新型雙重PCR技術(shù)能準(zhǔn)確檢驗(yàn)鴨疫里默氏桿菌，對(duì)檢測(cè)的所有不同血清型鴨疫里默氏桿菌菌株均能擴(kuò)增出364 bp和627 bp兩條特異的目的片段，而對(duì)鴨致病性大腸桿菌、鴨源禽巴氏桿菌、腸炎沙門氏菌、黃桿菌等對(duì)照菌株的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；該P(yáng)CR方法對(duì)細(xì)菌HXb2基因組DNA和菌液的檢測(cè)敏感性分別為17.33 ng/mL DNA和2.9×10

4、3 CFU/mL細(xì)菌。利用建立的雙重PCR檢測(cè)了鴨疫里默氏桿菌感染鴨的肝臟和腦組織中的鴨疫里默氏桿菌，結(jié)果顯示該方法與細(xì)菌分離法符合率分別為100％（9/9）和77.8%(7/9)，表明本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法可用于檢測(cè)肝臟組織中鴨疫里默氏桿菌。本研究建立的雙重PCR方法既可以對(duì)分離的鴨疫里默氏桿菌疑似菌株進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定，也可以直接用于臨床樣品中鴨疫里默氏桿菌的檢測(cè)。
　　試驗(yàn)二是鴨疫里默氏桿菌分離株的卡那霉素藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)

5、選取了貴州大學(xué)送檢的17株鴨疫里默氏桿菌，進(jìn)行雙重PCR鑒定、血清學(xué)鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，這些分別屬于1、2、5和15型鴨疫里默氏桿菌；且所有分離自貴州大學(xué)不同血清型的鴨疫里默氏桿菌菌株都對(duì)卡那霉素耐受。此外，本實(shí)驗(yàn)室常用的鴨疫里默氏桿菌如CH3、HXb2、Yb2和WJ4等也均對(duì)卡那霉素耐受。
　　試驗(yàn)三是將鴨疫里默氏桿菌的Yb2株為受體菌，將質(zhì)粒pEP4351轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW19851，構(gòu)建得到BW19851（pEP4351

6、）作為供體菌，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的濾膜接合轉(zhuǎn)移法技術(shù)將質(zhì)粒pEP4351導(dǎo)入受體菌鴨疫里默氏桿菌Yb2株中，使轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機(jī)插入鴨疫菌株的基因組中。由于Tn4351上有紅霉素抗性基因和Yb2對(duì)多黏菌素耐藥，通過(guò)微量肉湯稀釋法測(cè)定鴨疫和大腸桿菌BW19851對(duì)紅霉素和多黏菌素的最小抑菌濃度（MIC），以紅霉素0.3μg/mL和多粘菌素125μg/mL進(jìn)行陽(yáng)性接合子的篩選。構(gòu)建的隨機(jī)突變庫(kù)，通過(guò)卡那霉素抗性實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)突變株進(jìn)行篩選，初步尋找

7、到鴨疫卡那霉素抗性減弱的突變株，對(duì)突變株的最小抑菌濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定突變株是否對(duì)卡那霉素失去耐藥性或耐藥明顯減弱。對(duì)驗(yàn)證后的突變株結(jié)果觀察，篩選到了卡那霉素耐藥性明顯減弱的突變株DK-2。采用基因組步移法擴(kuò)增測(cè)定轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)在核糖體50S的L27亞基。
　　PCR擴(kuò)增野生株的50S L27基因ORF，連入大腸桿菌-鴨疫里默式桿菌穿梭表達(dá)載體pRES51，得到互補(bǔ)質(zhì)粒pRES-50S-L27，然后通過(guò)接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將互補(bǔ)質(zhì)粒導(dǎo)

8、入突變株DK-2中，通過(guò)紅霉素和多黏菌素抗性篩選和PCR檢測(cè)鑒定，得到了互補(bǔ)菌株cDK-2。然后測(cè)定野生株、突變株和互補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，野生株、突變株及其基因互補(bǔ)株的生長(zhǎng)曲線差異不大；但DK-2的MIC比野生株Yb2和cDK-2低8倍左右?；貜?fù)株cDK-2和野生株Yb2的卡那霉素藥敏片直徑為0，對(duì)kana是耐受的；而突變株DK-2的卡那霉素藥敏片直徑為10mm，表現(xiàn)對(duì)kana有低度敏感。另外，與野生株Yb2和互補(bǔ)株cD