1型鴨疫里默氏桿菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及抗體檢測方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一種革蘭氏陰性菌，火雞、水禽等對其敏感。它是鴨疫里默氏桿菌病的病原體，主要引起宿主的纖維素性氣囊炎、腦膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性輸卵管炎，并伴有不同程度的敗血癥，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展存在著巨大的威脅。因此，開發(fā)鴨疫里默氏桿菌病的疫苗對防止該疫病的發(fā)生有重大意義。同時，建立一種診斷鴨疫里默氏桿菌抗體的方法也對臨床實踐中監(jiān)測免疫效果、診斷疾病具有指導(dǎo)意義。本試驗中對限

2、鐵環(huán)境中的RA以及正常培養(yǎng)環(huán)境中的RA的分泌蛋白進行差異比較，發(fā)現(xiàn)其差異表達的蛋白，并對差異蛋白的免疫原性進行鑒定。此外，利用重組ompA蛋白作為包被抗原，建立了檢測RA抗體的間接ELISA方法，主要完成以下研究工作：
　　 通過模擬動物機體內(nèi)的限鐵環(huán)境，在限鐵環(huán)境中培養(yǎng)RA。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)，利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)，鑒定出在限鐵環(huán)境中有23個蛋白質(zhì)點表達量上升，選取其中的12個蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，分別代表了8類蛋白

3、質(zhì)，包括Ⅲ型纖維連接蛋白、分泌蛋白家族蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、亮氨酸富集蛋白質(zhì)、2類RA假想蛋白、似半乳糖結(jié)合區(qū)域蛋白、延伸因子。
　　 選取理論等電點、分子量和實際等電點、分子量相近的蛋白質(zhì)Fe10和Fe19(hypothetical protein Riean_1750和hypothetical protein Riean_1752)進行原核表達。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Fe10和pET-28a(+)-Fe19，

4、并通過蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達技術(shù)，表達出Fe10和Fe19蛋白。經(jīng)過鎳親和層析純化，獲得了較高純度的RA的Fe10和Fe19兩種蛋白。
　　 通過Western-blotting分析，表明蛋白質(zhì)Fe10和Fe19與RA的陽性血清是有反應(yīng)性的。通過鴨的免疫攻毒試驗，證明蛋白質(zhì)Fe10和Fe19對鴨具有一定的免疫保護性。且兩種蛋白同時配合免疫，比單獨一種蛋白作為免疫原具有更好的免疫保護力。
　　 此外，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28

5、a(+)-ompA，經(jīng)過誘導(dǎo)表達后，表達出RA的ompA蛋白。經(jīng)過純化的重組ompA蛋白作為包被物，以方陣滴定法確定抗原包被濃度為1.5μg/mL，待檢血清稀釋度為1:100。
　　 與普通的微量凝集試驗相比，該方法靈敏度較高，比凝集試驗高16-128倍。與鴨源大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、鏈球菌、呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒感染鴨血清均無交叉反應(yīng)，表明該方法特異性強。ompA蛋白作為抗原包被到酶標(biāo)板之后于-20℃保存時間為3個月