Tn916誘變的嗜水氣單胞菌突變株的特性分析及轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的探討.pdf

1、　　嗜水氣單胞菌(Ah)是重要的水生病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還是重要的人畜共患病病原菌?！　”疚难芯繉?duì)象MJ-1即是采用轉(zhuǎn)座子Tn916誘變技術(shù)獲得的一株多個(gè)毒力因子同時(shí)缺失的突變株，將其連傳20次后，Tn916仍穩(wěn)定地存在于MJ-1的染色體上。分析MJ-1的生物學(xué)特性，與親本株相比，其胞外蛋白酶(酪蛋白酶和彈性蛋白酶)、淀粉酶、DNA酶、溶血素和S層等幾種主要毒力因子不表達(dá)；生化特性表明，MJ-1對(duì)部分糖的發(fā)酵能

2、力丟失；外膜蛋白圖譜、胞外產(chǎn)物圖譜發(fā)生改變；對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附性小；對(duì)EPC細(xì)胞和小白鼠的毒力丟失。MJ-1株同時(shí)缺失多種分泌性胞外毒力因子和細(xì)胞表面蛋白如S層等，提示嗜水氣單胞菌J-1株中可能存在毒力島?！　榇_定Tn916的插入位點(diǎn)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增調(diào)控胞外蛋白酶分泌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(ahyR)全長(zhǎng)基因，結(jié)果未擴(kuò)增得到，推測(cè)Tn916可能插入到ahyR基因中。進(jìn)一步采用插入誘變技術(shù)構(gòu)建ahyR基因的突變株以驗(yàn)證Tn916是否插

3、入ahyR基因中。根據(jù)GenBank公布的嗜水氣單胞菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ahyR基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR方法擴(kuò)增AhJ-1株ahyR基因的部分片段(656bp)。PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體，經(jīng)序列測(cè)定后定向連接入含有卡那霉素抗性(Kmr)基因的自殺性質(zhì)粒pJP5603中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJP-ahyR。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AhJ-1株感受態(tài)細(xì)胞，獲得一突變株細(xì)菌。PCR方法鑒定該突變株為J-1株ahyR基因的同源重

4、組突變株，命名為J-1△ahyR。同時(shí)研究了其主要生物學(xué)特性。　　采用MJ-1株作為弱毒活疫苗免疫劍尾魚。將劍尾魚分成4組，免疫組每尾腹腔注射菌數(shù)分別為107CFU、105CFU、103CFU，對(duì)照組注射0.1mL無菌PBS，30d后采血測(cè)血清凝集抗體效價(jià)以及血液中白細(xì)胞的吞噬活性，而后用20LD50的Ah強(qiáng)毒株J-1株腹腔注射攻擊。每尾注射107CFU組的凝集抗體效價(jià)、白細(xì)胞的吞噬活性和相對(duì)保護(hù)力等都比其他免疫組高。試驗(yàn)結(jié)果表明弱毒