嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因突變株的構(gòu)建及外膜蛋白的研究.pdf

1、　　致病性嗜水氣單胞菌(Ah)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的重要病原之一，研究其毒力因子對(duì)了解該菌的致病機(jī)制具有重要的意義。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)與動(dòng)植物的許多革蘭氏陰性病原菌的毒力因子的分泌有關(guān)。本研究從嗜水氣單胞菌J-1株中克隆出Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因，成功構(gòu)建了其缺失突變株；另外對(duì)嗜水氣單胞菌的外膜蛋白OMPⅡ進(jìn)行了研究。　　根據(jù)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物，以嗜水氣單胞菌AhJ-1株

2、的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出一段大小約為710bp的核苷酸片段。將該片段克隆至質(zhì)粒載體pMD18-T中，隨后進(jìn)行測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明：擴(kuò)增出的基因片段與嗜水氣單胞菌AH3株Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的AscV基因有96﹪的同源性，與殺鮭氣單胞菌的同源性為86﹪，與溫和氣單胞菌的同源性為85﹪。在檢測(cè)的39株嗜水氣單胞菌中，37株致病菌都擴(kuò)增出目的片段，而另外2株非致病菌沒(méi)有目的片段擴(kuò)出，推測(cè)AscV基因?yàn)橹虏【晁赜??！　?/p>

3、含有卡那霉素抗性(Kmr)基因的自殺性質(zhì)粒pJP5603及連入T載體的AscV基因PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切后，回收3.0Kb與713bp的目的片段，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞cc118λpir，利用Kmr進(jìn)行篩選，獲得的克隆經(jīng)EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切及PCR鑒定，確定得到重組質(zhì)粒，命名為pYYAscV。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌J-1株，篩選到的克隆經(jīng)PCR鑒定，得到1個(gè)突變株，命名為AhJ-1△AscV。同時(shí)研究了該突變株的主

4、要特性，與親本株相比，其胞外蛋白酶、淀粉酶以及溶血素均檢測(cè)不到?！　「鶕?jù)已經(jīng)發(fā)表的外膜蛋白基因porinⅡ的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)中的18株嗜水氣單胞菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，有¨株擴(kuò)增出1008bp的目的片段。用十二烷基肌胺酸鈉抽提結(jié)合高速離心純化，制備了18株嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白(MOMP)。經(jīng)SDS-PAGE圖譜發(fā)現(xiàn)，porinⅡ基因檢測(cè)為陽(yáng)性的菌株具有39kD的蛋白條帶，進(jìn)一步用