pfm基因?qū)︺~綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的影響.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)為一種常見的能夠生存于多種自然生境和動植物組織中革蘭氏陰性細(xì)菌。它是臨床最普遍的引發(fā)院內(nèi)嚴(yán)重獲得性感染的條件致病菌，常引發(fā)急性或慢性感染，如燒傷傷口感染、下呼吸道感染、泌尿道感染以及醫(yī)院獲得性肺炎等。能夠產(chǎn)生生物被膜的粘液型菌株可以定植在呼吸系統(tǒng)表面，引發(fā)肺囊性纖維化(CF)和彌漫性泛支氣管炎等。它能夠成功感染宿主細(xì)胞主要歸功于它產(chǎn)生并分泌的一系列毒力因子，其中Ⅲ型分泌系

2、統(tǒng)能夠通過其針狀結(jié)構(gòu)將四種毒力因子直接注射至宿主細(xì)胞而引起宿主細(xì)胞的凋亡，是一種重要的毒力形成機(jī)制，因此對于Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)作用機(jī)制的研究具有重要的科學(xué)意義和臨床意義。
　　本文的出發(fā)菌株為銅綠假單胞菌臨床分離株P(guān)A68、實驗室前期構(gòu)建所得pfmMu轉(zhuǎn)座子插入突變株I69，提取了野生型PA68和pfm突變株I69的RNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜(microarray)分析。結(jié)果顯示，在突變株I69中，很多Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)水平都有不

3、同程度的降低。為此，以模式菌株P(guān)AO1為背景，敲除pfm基因得到基因缺失株P(guān)AO1Δpfm進(jìn)行進(jìn)一步研究。利用啟動子-lacZ融合子的β-半乳糖苷酶活性測定法測定野生型和缺失株的啟動活性差異，構(gòu)建效應(yīng)蛋白ExoS、ExoT的啟動子區(qū)域融合質(zhì)粒PDN19lacΩ-PexoS、PDN19lacΩ-PexoT，β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果表明PAO1Δpfm中的PexoS、 PexoT的啟動活性明顯低于野生型，說明由于pfm基因的缺失，Ⅲ型分泌

4、系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白ExoS、ExoT的表達(dá)受到了影響。ExoS作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)的一個重要效應(yīng)蛋白，它的表達(dá)量可以作為Ⅲ型分泌系統(tǒng)整體翻譯表達(dá)的一種表征，SDS-PAGE、Western blot結(jié)果表明，無論是在菌體內(nèi)還是分泌到菌體外環(huán)境，PAO1Δpfm中ExoS的含量均低于野生型，而基因回補(bǔ)株pfmC中則基本回復(fù)野生型的表達(dá)水平。提取野生型PAO1和缺陷型PAO1Δpfm的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time qPCR，檢測野生型和

5、缺失株中Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要基因exoS、exoT、exoY、pscJ、pscC、pcrV、popB及群體密度感應(yīng)系統(tǒng)(QS)重要基因lasR、lasI、rhlR、rhlI的表達(dá)水平差異，結(jié)果表明相比于野生型，缺失株中Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因表達(dá)有較顯著的下降，而群體密度感應(yīng)系統(tǒng)基因表達(dá)水平則有所升高。前期文獻(xiàn)結(jié)果表明群體密度感應(yīng)系統(tǒng)可以負(fù)調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)，因此通過影響群體密度感應(yīng)系統(tǒng)，可能是pfm間接影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)的原因之一。另外，酵母雙雜交實